技术分享：ERGIC-Rab蛋白双重调控TMED10介导的非经典分泌途径
蛋白分泌是细胞间信息传递的核心机制，其中分泌物的跨膜转运是重要的一环。经典蛋白分泌途径是通过内质网-高尔基体途径，起始于信号识别颗粒和转运体SEC61的连续作用，SEC61可识别分泌蛋白的信号肽并将其转移到内质网中[1, 2]。内质网-高尔基体运输是由外壳蛋白II（COPII）和COPI囊泡所介导，最终将分泌物释放到细胞外[3]。然而越来越多的研究发现，许多缺乏信号肽的蛋白质（称为无导向蛋白）的运输独立于内质网-高尔基体途径，这一过程被称为非经典蛋白质分泌（UcPS）[4]。UcPS涉及几种不同的蛋白质运输方式。其一分泌物可以直接渗透出质膜，称为I型非常规分泌，如成纤维细胞生长因子2[5]；其二分泌物通过囊泡运输，涉及膜融合，称为III型非常规分泌[6]。越来越多的证据表明UcPS参与各种生理和病理过程，包括炎症、发育、病毒感染、脂质代谢、神经退行性疾病和癌症[7]。
有研究表明，含Emp24结构域蛋白10（TMED10）介导的UcPS通路（THU）可将多种无导向蛋白转运出膜[8]。THU通路似乎是分泌性自噬和溶酶体介导的UcPS的上游步骤，已被证明可以调节白细胞介素IL-1β的分泌[9]。与经典分泌中SEC61介导的向内质网易位类似，TMED10促进UcPS分泌物进入内质网-高尔基体中间体（ERGIC）。THU利用ERGIC作为易位的关键位点来启动UcPS。之前的证据表明ERGIC在内质网-高尔基体经典分泌中也具有调节作用。然而，ERGIC如何区分其经典与非经典的分泌功能，以及THU在ERGIC上如何受到细胞内分子机器的调控，仍是亟待解决的问题。
2024年7月，Nature Cell Biology期刊报道了一项研究，发现定位于内质网-高尔基体中间体（ERGIC）的Rab 蛋白通过TMED10参与调节非经典蛋白质分泌（UcPS）。具体而言，Rab1A和Rab1B增强TMED10的转运蛋白活性，促进UcPS蛋白转运到ERGIC，而Rab2A在KIF5B的协助下调节ERGIC区室化，建立UcPS特异性区室。该研究揭示了三个定位于ERGIC的Rab蛋白在TMED10介导UcPS中的调控作用及其机制，为理解非经典分泌途径的分子机制提供了新见解，还提出了ERGIC功能区室化的新概念，为ERGIC功能的多样性提供了新的理论依据[10]。
首先，研究者利用之前已经建立的细胞系统，即通过在培养的细胞中表达无导向蛋白来研究UcPS，例如促炎细胞因子IL-1β（mIL-1β）的成熟形式，来模拟囊泡介导的UcPS。在体外HEK293T细胞的mIL-1β分泌测定中，同时过表达各种Rab小GTP酶。结果发现，Rab8A的表达增加了IL-1β的分泌，这与之前的研究一致[9]。Rab5A表达也观察到类似的效果，表明内体参与了UcPS（图一a）。有趣的是，ERGIC定位的Rab1A、Rab1B和Rab2A表达后也对IL-1β的分泌有显著影响（图一a）。在Hela细胞中证实了内源性Rab1A、Rab1B和Rab2A定位在ERGIC（图一b）。蛋白水平也证实Rab1A、Rab1B和Rab2A的促进IL-1β分泌作用（图一c）；对它们分别敲降显著减少了IL-1β的分泌，并可通过重新表达Rab1或Rab2A来恢复（图一d-f）；同时敲降Rab1A和Rab1B后，IL-1β分泌的抑制作用更明显（图一g）。以上结果表明，ERGIC定位的Rab1和Rab2A可调节成熟IL-1β的释放。
图一 Rab1A、Rab1B和Rab2A调节IL-1β的分泌[10]
Rab1和Rab2可调节内质网和高尔基体之间的双向转运[11]。为了研究它们对UcPS的调节作用，研究者利用布雷非德菌素A（BFA）来阻断内质网-高尔基体的转运，发现Rab1和Rab2A诱导的IL-1β分泌不受BFA处理的影响（图一h-j）。相比之下，传统分泌信号的ssGFP可被BFA阻断，但不受Rab1/Rab2A敲降的影响（图一k）。进一步分析THP-1细胞分化巨噬细胞的mIL-1β生理分泌，发现敲降Rab1/Rab2A会减少内源性mIL-1β分泌（图一l），而过表达则会增加mIL-1β的分泌（图一m）。研究者还分析了SW620细胞的内源性半乳凝素-3（Gal-3）分泌，出现了同样的结果（图一n和o）。研究者构建了不同的Rab点突变，将其锁定在组成型活性GTP结合状态或非活性GDP结合状态。结果显示，野生型（WT）和GTP结合型Rab（Rab1A-Q70L、Rab1B-Q67L和Rab2A-Q65L）会增加IL-1β的分泌，但GDP结合型Rab（Rab1A-S25N、Rab1B-22N和Rab2A-S20N）会显著抑制IL-1β的分泌（图一p-r）；而无核苷酸结合能力的突变体（Rab1A-N124I、Rab1B-N121I和Rab2A-N119I）对IL-1β的表达没有显著影响（图一s-u）。以上实验结果表明，Rab1A、Rab1B和Rab2A需要结合GTP来促进UcPS。
Rab1和Rab2A已被证明定位在ERGIC上[12]，并且与TMED10共定位，而TMED10是THU途径的关键蛋白[8]。于是，研究者探究Rab1和Rab2A是否通过THU途径来调节非经典分泌。在TMED10敲除（KO）细胞中，Rab1/Rab2A刺激的IL-1β分泌显著减少（图二a-c），表明Rab1/Rab2A调节UcPS需要TMED10。此外，GTP酶激活蛋白TBC1D20的表达，使得Rab1和Rab2A失活，抑制了TMED10刺激的IL-1β分泌（图二d）。Rab1/Rab2A的敲降也减弱了TMED10刺激的IL-1β分泌（图二e-g）。接着，研究者测试具有突变基序的IL-1β（IL-1β-WY/LL），破坏了TMED10结合分泌蛋白质的关键位点（图二h）。发现IL-1β-WY/LL的分泌不受Rab1/Rab2A表达的影响（图二i-k）。在外源表达或内源蛋白的免疫共沉淀实验中，Rab1/Rab2A均与TMED10相结合（图二l和m）；与Rab1相比，Rab2A与TMED10的结合较弱（图二l）。与GDP结合型突变体相比，Rab1/Rab2A的GTP结合型突变体更容易结合TMED10（图二n-p）。使用GST下拉测定发现，Rab2A与TMED10的结合比Rab1弱得多（图二q）。TMED10的C末端缺失（TMED10ΔCT）大大降低了与Rab1/Rab2A的结合（图二r-t）；TMED10的C末端在下拉分析中能直接与Rab1/Rab2A相结合（图二u-w）。以上实验结果表明，TMED10通过其C末端与Rab1/Rab2A相互作用。
图二 Rab1/Rab2A直接结合TMED10来共同调节IL-1β的分泌[10]
TMED10促进了UcPS分泌蛋白易位到ERGIC内腔中，这是囊泡介导UcPS的重要步骤[8]。研究者使用了一种荧光互补分析技术[8]，在HEK293T细胞中共表达mIL-1β-3×GFP11和GFP(1-10)-TMED10，以确定蛋白进入ERGIC（图三a）。FACS结果发现，GFP互补信号随着Rab1的表达而增强，但Rab2A没有（图三b）；敲降Rab1而不是Rab2A，GFP互补信号显著减弱（图三c）。Rab1对GFP信号的调节依赖于GTP结合， Rab1的GDP结合型突变体抑制了GFP互补信号（图三d和e）。Rab1的UcPS特异性突变体未能促进GFP互补（图三f）。与FACS分析一致，Rab1显著提高了ERGIC中IL-1β的表达量，IL-1β与TMED10共定位；Rab1敲降后，ERGIC中IL-1β的表达量显著减少，而Rab2A不影响IL-1β进入ERGIC（图三k-n）。随后，研究者对细胞中的膜组分进行分离，测定了膜囊泡的IL-1β表达水平。结果发现，Rab1的表达增加了膜组分中IL-1β的含量，但Rab2A的表达对膜组分中IL-1β的含量没有明显改变（图三g-i）。Rab1的敲降也显著减少了膜组分中IL-1β的含量（图三j）。以上实验结果表明，Rab1，而不是Rab2A，可调节UcPS分泌蛋白进入ERGIC。使用测定蛋白脂质体易位的方法[8]探究Rab1是否直接激活TMED10的易位活性（图三o）。单独存在Rab1，而不是Rab2A，可增加TMED10易位进入蛋白脂质体中IL-1β的量，使得它们受蛋白脂质体的保护，不被蛋白酶K消化所影响。添加GTP可进一步增强脂质体中的IL-1β水平，而添加GDP无效果（图三p-s）。以上实验结果表明，Rab1以GTP依赖的方式激活TMED10的易位活性。
图三 Rab1促进IL-1β进入ERGIC[10]
TMED10的转运能力取决于其寡聚化[8]，由此研究者探究Rab1能否调节TMED10寡聚化。交联实验结果显示，表达Rab1显著增加了TMED10的寡聚化，敲降Rab1降低了TMED10的寡聚化；TMED10寡聚化不受Rab2A和其他两种Rab表达的影响（图四a-c）。Rab1的GTP结合型突变进一步增强了TMED10的寡聚化，但GDP结合型突变降低了TMED10的寡聚化（图四d和e），免疫共沉淀实验也同样证实了这一结果（图四f和g）。TMED10的C末端缺失使得TMED10寡聚化对Rab1B表达不敏感（图四h），表明TMED10-Rab1相互作用是TMED10寡聚化增强所必需的。使用体外下拉实验来确定Rab1是否影响IL-1β和TMED10之间的相互作用，发现Rab1以GTP依赖的方式增强了TMED10和IL-1β的直接相互作用（图四i和j）。并且在GTP存在下，IL-1β也能增强TMED10和Rab1之间的相互作用，GDP则不行（图四k和l）。以上结果表明，Rab1、TMED10和IL-1β之间存在三重相互作用，Rab1可增加TMED10寡聚化及其与IL-1β的相互作用。
图四 Rab1可增加TMED10寡聚化及其与IL-1β的相互作用[10]
ERGIC的一个主要作用是调节内质网-高尔基体的运输，这对经典分泌来说是至关重要的[13]。于是，研究者进一步探究ERGIC如何在细胞中协调经典分泌和非经典分泌的双重功能。对TMED10和ERGIC53（经典分泌的标志物）染色的细胞进行结构光照明显微镜（SIM）观察，发现TMED10和ERGIC53并不完全共定位，超过50%的TMED10是单独存在的（图五a和b）。为确定TMED10阳性ERGIC的UcPS功能，研究者采用带有GFP(1-10)区域特异性标记的荧光互补分析方法（图五c）。鉴于TMED10本身促进UcPS蛋白运输，研究者构建了一种缺乏易位活性的截短TMED10蛋白（TMED10ΔGOLD）[8]，它仍定位于TMED10阳性ERGIC中（图五d）。结果显示，UcPS蛋白IL-1β-GFP11信号主要与GFP(1-10)-TMED10ΔGOLD互补（易位由内源性TMED10介导，图五e），而常规分泌蛋白IL-6-GFP11主要与GFP(1-10)-ERGIC53互补产生强烈的GFP信号（图五g）。ERGIC定位的IL-1β与TMED10的共定位比ERGIC53多些（图五f），而IL-6大多与ERGIC53共定位（图五h）。以上结果表明，ERGIC被划分为至少两个区域，分别标记为ERGIC53和TMED10，用于特异性调节经典和非经典分泌。接下来，研究者采用选择性钩保留（RUSH）系统，其中链霉亲和素结合肽（SBP）标记的TMED10ΔGOLD与链霉亲和素标记的ERGIC53一起表达来人为混合ERGIC区域（图五i和j）。发现当ERGIC53和TMED10两个区域相混合时，UcPS蛋白IL-1β的分泌受到显著抑制；当用生物素处理使得ERGIC分区重新建立后，IL-1β的分泌得到了恢复（图五j和k）。进一步使用光电关联显微技术（CLEM），发现ERGIC存在结构差异的两个不同分区：经典分泌的ERGIC（ERGIC53阳性）与高尔基体紧密偶联；而非经典分泌的ERGIC（TMED10单阳性）周围无高尔基体，表现为管泡状簇结构（图五l），揭示了ERGIC存在功能区室化的现象，不同结构可能具有特定的功能，ERGIC的区室分隔是有效释放UcPS蛋白所必需的。
图五 ERGIC存在功能区室化[10]
多项研究表明，Rab1和Rab2A调控内质网-高尔基体系统中的膜转运[14]，这促使研究者探究它们是否参与ERGIC的区室化。SIM观察结果显示，Rab2A过表达或敲降后，TMED10和ERGIC53之间的分离显著增加或减少（图六a，b，e和f），且Rab2A诱导的区域分离依赖于活性GTP结合（图六c和g）。为了确认Rab2A对ERGIC区室化的影响，研究者使用随机光学重建显微镜（STORM）量化COS-7细胞中ERGIC区室化，结果也证实ERGIC区室化随着Rab2A的敲降而降低，随着Rab2A过表达而恢复（图六d和h）。以上实验结果表明，Rab2A通过促进ERGIC区室化来促进UcPS。为进一步证实，研究者采用RUSH系统将ERGIC人为锁定在混合状态，结果发现，过表达Rab2A并没有改变ERGIC的混合状态，不能促进ERGIC区室化，UcPS蛋白IL-1β的分泌也没有进一步增加（图六i）。
图六 Rab2A调节ERGIC区室化[10]
先前研究表明，Rab2参与招募运动蛋白以促进囊泡运输[15]，且囊泡运输依赖于细胞骨架，细胞骨架是运动蛋白的轨道。TMED10介导的易位是囊泡依赖性UcPS的初始步骤，需要囊泡向下游转运以输出蛋白。于是，研究者首先确定细胞骨架在ERGIC区室化中的作用。使用一种微管聚合抑制剂诺考达唑处理后，ERGIC分散，TMED10和ERGIC53之间的分离减少，抵消了Rab2A调节ERGIC区室化的作用（图七a和b）。诺考达唑的处理抑制了IL-1β的分泌（图七c和d），表明ERGIC区室化是依赖于微管的。接下来，研究者寻找与Rab2A相互作用的微管相关运动蛋白。通过shRNA文库筛选，发现敲降四种运动蛋白显著降低了IL-1β的分泌，其中KIF5B最为显著（图七e）。免疫荧光分析结果也证实了Rab2A的表达增加了KIF5B的核周定位（图七f），且表达KIF5B显著增加了IL-1β的分泌（图七g），表明Rab2A调节ERGIC区室化需要KIF5B。KIF5B被鉴定为是Rab2A结合蛋白，对GTP结合形式具有特异性[16]。为确定KIF5B是否与Rab2A一起作用，研究者进行了KIF5B敲降，发现尽管Rab2A表达促进了IL-1β的分泌，但在KIF5B敲降后大大降低了Rab2A的促进作用（图七h），Rab2A促进的ERGIC区室化也被KIF5B敲降所中和（图七i和j）。KIF5B与Rab2A的WT和GTP结合型突变相结合（图七k），表明KIF5B是Rab2A的效应子。KIF5B也与TMED10相结合，通过敲除和过表达验证了Rab2A参与KIF5B-TMED10的结合（图七l）。以上结果表明，Rab2A可能有助于TMED10阳性的ERGIC加载到KIF5B上，推动ERGIC沿微管的分区。
图七 Rab2A调节ERGIC分区需要KIF5B[10]
综上所述，该研究揭示了ERGIC定位的Rab 蛋白Rab1和Rab2A在UcPS蛋白分泌中的双重调节作用。在非经典分泌途径中，Rab1A、Rab1B和Rab2A都定位于ERGIC。Rab1A和Rab1B可促进TMED10的寡聚化，进而促进UcPS分泌蛋白有效进入ERGIC。而Rab2A通过招募KIF5B，促进TMED10介导UcPS的特异性ERGIC隔室形成。UcPS分泌蛋白以膜囊泡的形式从ERGIC中出现，绕过高尔基体直接或通过形成分泌性自噬体运输到胞外（图七m）。
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