技术分享：焦亡细胞分泌的氧化脂质和代谢物可促进组织修复
焦亡是一种溶解性细胞死亡，是由gasdermin家族蛋白组成大的质膜孔洞所造成的。Gasdermin D（GSDMD）是炎症小体诱导细胞焦亡的主要执行者[1]。一旦质膜孔洞形成，caspase-1进一步介导炎症细胞因子的切割和释放，如白细胞介素IL-18、IL-1β和IL-1α[2]。炎症小体是一类细胞质蛋白复合物，其组装诱导涉及两种信号：信号1通常被Toll样受体（TLR）的配体所激活，促进NF-κB介导的炎症小体成分和促炎细胞因子（如pro-IL-1β）的转录上调；信号2可以由各种各样的因素所触发如ATP、微生物毒素和引起溶酶体损伤的晶体，从而促使炎症小体组装、caspase-1的募集和激活，最终导致细胞溶解[3]。
焦亡在限制感染扩散和清除受损细胞方面发挥着重要的作用，并且在无菌的炎症性病理如自身免疫性疾病、癌症和动脉粥样硬化中也存在，在某些非感染性环境中抑制焦亡也能获得受益。然而，仅仅中和IL-1β和IL-18等细胞因子并不能完全减轻焦亡和GSDMD激活所带来的影响，表明还存在其他作用因素。焦亡还会释放细胞本底及其新诱导产生的蛋白质[4]。此外，炎症小体的激活可以在没有IL-1β或IL-1α释放的情况下发生[5]。因此，在焦亡过程中还可能释放哪些其他小分子和代谢物，及其对邻近组织的影响还有待被探究。
2024年7月，Nature期刊报道了一项研究，利用不释放IL-1β或IL-1α的焦亡模型Pyro-1，发现Pyro-1分泌组具有意想不到的益处。Pyro-1上清液与靶细胞的共孵育，可上调与迁移、细胞增殖和伤口愈合相关的基因特征，促进原代成纤维细胞和巨噬细胞的迁移和体外伤口愈合，并能促进体内的组织修复。脂质组学和代谢组学鉴定出Pyro-1上清液中存在的氧化脂质和代谢物，具有促进伤口愈合的活性。其中氧化脂质前列腺素E2（PGE2）的合成是在caspase-1激活和环氧化酶-2活性下游的焦亡过程中重新诱导的，发生在焦亡后期，其释放取决gasdermin D孔洞，进而促进了巨噬细胞在伤口的聚集从而加速了组织损伤修复。该研究表明焦亡分泌组含有组织修复特性的氧化脂质和代谢物，可以用于伤口治疗[6]。
为了识别独立于IL-1β的焦亡分泌物作用，研究者利用NLRP1B炎症小体在无需TLR触发的信号2条件下可诱导焦亡的能力。C57BL/6小鼠的骨髓源性巨噬细胞（BMDM）对炭疽致死毒素（LeTox）具有抗性。然而，来自Nlrp1b转基因C57BL/6小鼠（Nlrp1b-Tg）的BMDM与LeTox一起孵育时会发生焦亡，且LeTox诱导焦亡发生时没有释放IL-1β或IL-1α[7]。研究者将这种焦亡称为Pyro-1，表示没有信号1触发因素，也没有IL-1β或IL-1α的释放。此外，当Nlrp1b-Tg巨噬细胞缺乏编码caspase-1和caspase-11的基因时（Casp1/11-KO），LeTox则无法触发焦亡，而是诱导凋亡（Apop）[7]。
为了研究Pyro-1分泌物如何与其他细胞进行交流，研究者将LeTox处理的C57BL/6对照组（细胞存活）和Nlrp1b-Tg（Pyro-1）小鼠来源的BMDM上清液加入到C57BL/6小鼠的初始BMDM中孵育4小时，并进行了RNA-seq分析。与对照上清液相比，Pyro-1上清液在M0巨噬细胞中诱导了显著的基因表达变化（图一a），上调基因显著富集在与细胞迁移、增殖和免疫反应（图一b），下调了脂质代谢基因。信号1相关的IL-18也在Pyro-1上清液中被检测到（图一c），为排除IL-18的贡献，研究者进一步敲除 Il18，获得Nlrp1-Tg-Il18 KO小鼠，称为Pyro−1-18。平行比较4组小鼠BMDM，LeTox处理后分别获得对照组（活细胞）、Pyro-1（焦亡）、Pyro−1-18（焦亡）和Apop（凋亡）上清液，用于培养M0巨噬细胞（图一c）。结果显示，Pyro-1和Pyro−1-18上清液显著上调了许多与伤口愈合和组织修复相关的基因，例如凝血酶敏感蛋白1（Thbs1）、血管内皮生长因子（Vegf）、核受体4a1（Nr4a1）和转谷氨酰胺酶2（Tgm2）；而Apop上清液则不行（图一c），表明Pyro-1上清液诱导的基因特征在很大程度上与IL-18无关。随后，研究者用蛋白酶K处理4种上清液来降解所含蛋白质，之后进行95℃热灭活（图一d，顶部）。发现蛋白酶K处理后的Pyro-1和Pyro−1-18上清液仍能显著诱导靶细胞的Thbs1、Vegf、Nr4a1和Tgm2表达（图一d）。以上数据表明，Pyro-1分泌组诱导了与细胞增殖和迁移相关基因的表达，及其发挥作用不依赖于所含的蛋白质。
图一 Pyro-1分泌组可诱导细胞增殖和迁移相关基因的表达[6]
接下来，研究者对Pyro-1上清液进行脂质组学研究，发现其富含氧化脂质包括PGE2，而对照和Apop上清液中没有（图二a）。比对一个公开RNA-seq数据集，其中PGE2直接添加到小鼠M0 BMDM，分析发现诱导变化基因与Pyro-1上清液诱导的一半基因相重叠，包括许多高度上调的基因（图二b），表明PGE2可能是Pyro-1上清液的主要作用成分。PGE2与伤口愈合有关，于是研究者进行体外伤口愈合试验。与对照组相比，Pyro-1和Pyro−1-18上清液显著增加了小鼠原代成纤维细胞单层划痕实验的伤口愈合（图二c），表明IL-18在这种情况下是不必要的。进一步测试Transwell迁移试验，发现Pyro-1上清液可诱导原代小鼠成纤维细胞和巨噬细胞的更多迁移，且这种作用同样独立于IL-18（图二d）。随后，研究者测试这种效应是否也能发生在人类髓系细胞上。用NLRC4炎症小体激动剂NeedleTox触发人CD14+血单核细胞的焦亡。这些焦亡上清液也能诱导成纤维细胞伤口愈合急剧增加，并且也检测到PGE2（图二e）。
图二 Pyro-1上清液中活性代谢物的鉴定[6]
接下来，研究者试图了解PGE2释放的动力学、来源和可能的释放模式。之前研究表明，从焦亡细胞中释放乳酸脱氢酶和IL-1β等蛋白质是一个动态调节的过程，其中膜通透性由GSDMD和NINJ1等控制，修复过程由ESCRT复合体介导[8]。在产生Pyro-1上清液的方法中，细胞在LeTox触发后90分钟内可渗透进7-氨基放线菌素D（7-AAD；质量为1270 Da）（图三a），而膜孔开放标志物LDH（依赖于NINJ1）在120分钟左右检测最高（图三b）。相比之下，对照组在相同的LeTox触发后的任何时间点都没有表现出膜渗透性或LDH释放，Apop组也无LDH释放（图三a和b）。LeTox触发后90分钟，可在Pyro-1上清液中检测到PGE2，并且在120分钟时水平显著更高（图三c）。进而探究释放的PGE2是来源于焦亡触发之前就已经存在于细胞中的，还是焦亡过程中新产生的。前列腺素由花生四烯酸通过环氧化酶-1（COX1）和COX2的活性合成。COX1和COX2的酶活性可以使用非甾体抗炎药来抑制，包括阿司匹林、布洛芬和吲哚美辛可抑制COX1和COX2，以及NS-398抑制COX2。此外，阿司匹林的抑制作用是不可逆的，但其他三种药物的抑制是可逆的。将Nlrp1b-Tg巨噬细胞预先用阿司匹林、布洛芬、NS-398或吲哚美辛处理过夜，在去除药物并诱导焦亡后，发现用可逆抑制剂布洛芬、NS-398或吲哚美辛处理的细胞上清液中PGE2水平恢复到未经药物处理的Pyro-1水平，而不可逆抑制剂阿司匹林阻断了PGE2的释放（图三d），表明在焦亡过程中诱导了COX1和COX2活性，这可能导致PGE2的从头合成和释放。在诱导焦亡后，测试不同时间点添加阿司匹林的情况，发现即使在LeTox触发后60分钟添加阿司匹林也都会显著降低PGE2水平（图三d），表明PGE2的产生和释放发生在焦亡的后期。
图三 焦亡过程中PGE2的从头合成可以促进体内伤口愈合[6]
触发焦亡后，炎症小体激活Caspase-1活性，这对诱导焦亡至关重要。为了测试Caspase-1活性是否有助于PGE2的释放，研究者构建了可诱导表达Caspase-1的人THP-1单核细胞。通过直接激活Caspase-1，也能显著诱导PGE2的释放（图三e）。进一步测试Caspase-1激活下游的GSDMD打孔是否有助于PGE2的释放。使用Nlrp1b-Tg Gsdmd KO小鼠祖细胞产生的HoxB8巨噬细胞诱导焦亡，Gsdmd KO后不会导致上清液中PGE2的释放；相比之下，对照组HoxB8巨噬细胞分泌了大量的PGE2；用GSDMD打孔抑制剂双硫仑处理后，完全抑制了PGE2的释放（图三f），表明焦亡细胞释放PGE2需要形成GSDMD孔。为了测试释放到Pyro-1上清液中的PGE2是否具有体内功能，研究者使用一种检测伤口愈合的结肠穿刺活检模型，在小鼠远端结肠的不同部位手术引入多个伤口，该模型的组织修复完全依赖于生物活性PGE2的局部存在。当小鼠全身施用COX2抑制剂NS-398时，大大延迟了结肠损伤的伤口愈合，导致受伤部位出现纤维蛋白凝块。通过灌肠局部施用对照或Pyro-1上清液后，第4天评估损伤部位的伤口愈合面积，发现Pyro-1上清液显著促进了结肠伤口的修复（图三g）。伤口相关上皮细胞在肠屏障重建中起着关键作用，Claudin-4是PGE2在伤口相关上皮细胞中诱导的特异标志物[9]。与此相一致，数据显示Claudin-4阳性上皮细胞在Pyro-1组伤口上延伸（图三h）。以上数据表明，PGE2是Pyro-1上清液中的生物活性物质。
最后，研究者在小鼠全层皮肤损伤模型中测试Pyro-1上清液（图四a），该模型仅部分依赖于PGE2进行组织恢复。当在受伤后第0、1和2天皮内注射上清液时，Pyro-1组对伤口愈合有着积极的影响（图四a）。阿司匹林处理的Pyro-1（Asp）上清液显示出部分的促伤口愈合作用（图四b），提示Pyro-1上清液中除氧化脂质以外的成分可能有助于改善组织修复。尽管凋亡上清液不含氧化脂质（图四c），但是在伤口闭合方面仍有显著的较小改善（图四d）。这促使研究者检查Pyro-1上清液中其他活性代谢物。在LeTox触发焦亡后90分钟和120分钟，对Pyro-1上清液进行非靶向代谢组学研究，发现Pyro-1分泌组包含许多“独特”代谢物，以及凋亡细胞分泌组中也存在的“共享”代谢物（图四e）。
图四 Pyro-1上清液中的代谢物和氧化脂质促进伤口愈合[6]
伤口修复的早期阶段，通常称为炎症阶段，伴随着巨噬细胞和中性粒细胞快速浸润到损伤部位，这有助于预防感染，同时促进伤口修复。为了更好地理解Pyro-1上清液中代谢物对体内伤口部位免疫细胞迁移和/或极化的调节作用，收集第3天全层皮肤伤口，分析免疫细胞浸润情况。经Pyro-1上清液处理的伤口显示出CD45+细胞和CD45-细胞数量增加，以及F4/80+和CD64+巨噬细胞的显著增加（图四f）。先前的工作已经确定，皮肤单核吞噬细胞是皮肤间质细胞群的主要组成部分，其中促进修复伤口部位的巨噬细胞表达凝集素CD301，它是一种极化标志物[11]。此外，伤口部位巨噬细胞的CD301+CD206+群体倾向于表达更多的IL-10和TGFβ，促进了再上皮化和成纤维细胞募集，进而促进伤口愈合。用上清液孵育M0巨噬细胞，发现Pyro-1上清液孵育24小时后，CD301+细胞的百分比明显增加，每个细胞表面CD301表达水平也增加，IL-18在很大程度上不起作用（图四g）。值得注意的是，Pyro-1上清液在诱导巨噬细胞CD301极化方面的作用与PGE2无关，因为阿司匹林处理的Pyro-1（Asp）上清液在诱导CD301+细胞方面同样有效（图四h），表明PGE2以外的成分介导了这种作用。测试Pyro-1上清液是否调节体内CD301的表达，收集第3天皮肤伤口分析CD45+CD64+和CD45+F4/80+细胞中CD301的表达，发现每单位伤口面积的CD301+细胞显著增加（图四i）；表达CD301+巨噬细胞分泌细胞因子IL-27的细胞也更多（图四j）。进一步在小鼠造模中施用一种IL-27阻断抗体，显著减少了Pyro-1上清液的伤口愈合作用（图四k），表明Pyro-1上清液显著诱导了分泌IL-27的CD301+巨噬细胞，进而增强伤口愈合。IL-1β会延缓伤口愈合[10]。在炎症期高峰期（IL-1β最高值），即从第2天至第4天在伤口部位施用上清液，Pyro-1上清液仍能促进伤口愈合（图四l），表明Pyro-1上清液仍然可以在伤口愈合的炎症阶段获得受益。
综上所述， 研究者证明缺乏IL-1β的焦亡细胞分泌组可以成为组织修复的有力促进因子。首先，Pyro-1分泌组含有氧脂质和代谢物，在体内协同促进伤口闭合。其次，PGE2等氧化脂质的产生是在caspase-1激活的下游从头合成的，PGE2的释放依赖于GASDMD孔。第三，根据生物信息学分析，PGE2贡献了Pyro-1上清液诱导的约50%的基因特征，与此相一致，氧化脂质对全层伤口模型的愈合提供了部分益处，其余的作用归因于Pyro-1上清液中的其他代谢物。第四，Pyro-1上清液促进了伤口部位与伤口愈合有关的巨噬细胞亚群的富集。该研究为治疗伤口修复提供了新的线索，有望用于相关疾病的组织修复治疗。
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