技术分享：TM7SF3通过调控TEAD1剪接抑制MASH诱导的肝纤维化
非酒精性脂肪肝病（NAFLD），现已更名为代谢功能障碍相关脂肪变性肝病（MASLD），其特征是肝脏出现脂肪的过度积累，伴随着轻度或无炎症[1]。预计约25%的MASLD患者会发展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH；之前称为NASH），后者的特征是脂肪变性、肝脏炎症、肝细胞气球样变性和纤维化[2]。肝纤维化是MASH患者死亡率和不良肝脏事件的主要预测指标，由肝星状细胞（HSC）的激活所引起[3]。在MASH中，静息HSC被激活转变为增殖、纤维发生和收缩性增强的肌成纤维细胞，分泌和沉积纤维状的细胞外基质（ECM），导致肝脏瘢痕形成[3]。该过程包括了炎症、细胞应激、外泌体、ECM相互作用和游离胆固醇的一整个复杂信号网络，促进HSC的激活。因此，抑制HSC活化对于预防和减少MASH纤维化至关重要。
TEAD1是转录增强相关DNA结合结构域转录因子家族成员[4]，是Hippo通路组分之一，与炎症、纤维化和癌症等疾病相关。TEAD1与转录共激活因子YAP 和TAZ（Hippo信号转导级联的末端核效应因子）相互作用，促进靶基因表达、细胞生长和存活。这种严格调控的信号级联涉及YAP/TAZ的磷酸化，限制其核转位及其与TEAD1的相互作用，从而影响靶基因的表达[5]。TEAD1靶基因，包括Ctgf和Cyr61，通过促进纤维化组织重塑和增强细胞增殖和分化来促进纤维发生[6]。尽管研究已经建立TEAD1与Ctgf和Cyr61等纤维化相关基因之间的联系，但TEAD1在激活HSC中的作用仍未被探索。
2024年5月，Cell Metabolism期刊报道了一项研究，发现核蛋白TM7SF3的缺失会加速肝星状细胞（HSC）的活化，从而激活纤维化程序和HSC增殖。机制上，TM7SF3敲除后剪接因子hnRNPU促进了Hippo通路转录因子TEAD1的选择性剪接，导致抑制性外显子5的缺失，产生更活跃的TEAD1形式，触发HSC激活。基于此，设计特异性反义寡聚体（ASO）来抑制TEAD1的选择性剪接，可以在体外促使HSC失活，并且减少MASH饮食诱导的小鼠肝纤维化，表明TM7SF3在减轻HSC活化和MASH相关纤维化进展中起着关键作用[7]。
七次跨膜蛋白TM7SF3是一种核蛋白，可以减弱内质网（ER）应激和未折叠蛋白反应的发展[8]。TM7SF3与多种RNA结合蛋白/剪接因子形成复合物，如HNRNPU、HNRNPK和RBM14，从而在基础和应激条件下抑制选择性剪接[9]。与大多数七次跨膜蛋白不同，TM7SF3广泛表达，包括在肝脏中。研究者前期发现，U2-OS细胞中的TM7SF3敲降（KD）导致基因表达谱的变化与肝纤维化/HSC激活谱式高度相似[9]。与此一致，研究者发现CCl4处理或MASH饮食（图一A）诱导的活化HSC中Tm7sf3 mRNA的表达降低。因此，研究者推测TM7SF3调节HSC活化和肝纤维化，并对此进行验证。使用由野生型（WT）肝细胞和非实质细胞（NPC）构建的肝脏类器官模型，混合HSC细胞进行培养，其中HSC来源于WT（WT-HSC）小鼠或诱导型全身TM7SF3 KO小鼠（KO-HSC；图一B）。在24孔超低粘附板上培养14天后，这些细胞组成球状的肝脏类器官，含有多种肝脏细胞类型，并表达更高水平的纤维化和炎症基因[10]。使用脂肪酸混合物处理肝脏类器官模拟MASH过程，可以激活其纤维化和炎性基因表达。于是，研究者使用较低剂量的脂肪酸混合物来处理含有WT-HSC或KO-HSC的类器官，发现在没有脂肪酸混合物处理条件下，与WT-HSC类器官相比，KO-HSC导致Tgfb1、Timp1和Mcp1的表达增加。脂肪酸混合物诱导WT-HSC类器官的脂质代谢基因上调，对纤维化和炎症基因表达的影响很小；相比之下， KO-HSC诱导了一系列纤维化和炎症相关的基因和蛋白质表达增加，包括Tgfb1、Col1a1、Timp1和Mcp1（图一C和D）以及ECM蛋白的产生和分泌显著增加（图一E）。使用siRNA体外沉默小鼠原代HSC中的Tm7sf3基因，qPCR证实KD后Tm7sf3表达减少了90%，以及纤维化基因表达明显高于对照组（图一F）。进一步评估TM7SF3在人原代HSC中的作用，TM7SF3 KD同样导致纤维化基因在mRNA和蛋白质水平上的表达增加（图一G）。此外，TM7SF3 KD后观察到HSC增殖增加，Ki67 mRNA水平升高（图一H）和Ki67阳性细胞数量增加（图一I）。以上结果表明，TM7SF3抑制了人和小鼠HSC的分化和活化，并减少肝脏类器官的纤维化和炎症。
图一 TM7SF3 KO通过促进HSC活化和细胞增殖诱导肝脏类器官和HSC的纤维化[7]
研究者进一步评估TM7SF3 KO对HSC活化和肝纤维化的影响。通过将Tm7sf3-floxed小鼠与Lrat-Cre小鼠杂交构建肝脏HSC特异性Tm7sf3敲除小鼠（HSC-TM7SF3KO）。使用西方饮食（WD；AIN-76A）和他莫昔芬诱导HSC-TM7SF3KO小鼠并评估表型。如图二G所示，在正常饮食（NCD）的HSC-TM7SF3KO或WT小鼠中没有检测到明显的胶原蛋白积聚。在WD喂食6周后，与WT相比，HSC-TM7SF3KO小鼠的肝脏羟脯氨酸含量呈上升趋势。在WD喂食16周后，HSC-TM7SF3KO肝脏的α-SMA免疫染色和COL1A1和TIMP1蛋白表达高于WT（图二A-C）。这种表型与炎症标志物的表达增加相吻合，如F4/80、Mcp1和Cd68基因以及血清IL-1β、TNF-α和MCP1水平升高（图二D和E）。与WT相比，HSC-TM7SF3KO的血液丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平显著升高（图二F）。然而，在肝脏甘油三酯（TG）或总胆固醇水平方面没有观察到显著变化。重要的是，通过天狼星红染色和羟脯氨酸测量评估，HSC-TM7SF3KO小鼠的肝纤维化明显高于WT（图二G和H）。以上数据进一步强调了TM7SF3在促进HSC活化和肝纤维化中的作用。
图二 HSC特异性TM7SF3 KO加重MASH诱导的肝纤维化[7]
选择性剪接（AS）可以通过剪接出多种不同基因形式来调节肝脏生理，如转录因子TEAD1。之前的研究表明，TEAD1在肝损伤后会发生AS，从而调节其活性[11]。TEAD1前体mRNA包含一个12 nt的外显子5，编码DNA结合螺旋H3下游的四个氨基酸VTSM。于是，研究者研究HSC中TEAD1的AS是否与肝损伤和MASH有关。发现与健康人群和MASLD患者相比，MASH患者肝脏中TEAD1的表达显著升高（图三A）。评估MASH饮食5个月的小鼠肝细胞、NPC和HSC中的TEAD1 AS，发现HSC中的TEAD1 AS高出约6倍, 肝细胞中TEAD1 AS没有增加（图三B）。TEAD1外显子5包括一个保守的丝氨酸残基，该位点磷酸化时，会强烈抑制TEAD1的DNA结合能力，使其相对无活性，而缺失这个外显子会增加TEAD1的转录活性[11]。事实上，研究者发现人类HSC和U2-OS细胞中的TM7SF3 KD会促进外显子跳跃，导致TEAD1△Ex5的增加（图三C和D）。由此，研究者设计一种名为“siTEAD1△Ex5”的siRNA，靶向抑制外显子5的跳跃剪接（图三E）。在人HSC中测试其抑制效率和特异性，显示siTEAD1△Ex5没有抑制TEAD1的表达，而siTEAD1导致了60%的下降（图三F和G）。重要的是，siTEAD1△Ex5有效沉默了TM7SF3 KD诱导的TEAD1的选择性剪接活性形式（图三F）。TEAD1靶基因CTGF和CYR61的减少，也证明siTEAD1△Ex5特异性抑制了TEAD1△Ex5活性形式（图三H和I）。siTEAD1△Ex5还抑制了TM7SF3 KD诱导的HSC活化标志物ACTA2和纤维化细胞因子Il-6的表达（图三J和K）。检测siTEAD1△Ex5在肝脏类器官系统中减少纤维化的能力，在用脂肪酸混合物培养14天的过程中，每3天用siTEAD1△Ex5或对照siCON转染肝脏类器官。结果显示，抑制TEAD1△Ex5导致纤维化基因和蛋白质表达显著降低，但不改变炎症标志物MCP1的表达（图三L和M）。有趣的是，与对照组相比，siTEAD1△Ex5抑制TEAD1△Ex5时，HSC静息状态的标志物Bambi的表达更高（图三L）。最后，评估TM7SF3和TEAD1△Ex5对HSC增殖的影响。TM7SF3 KD促进了HSC增殖（图三N）。在基础状态下抑制TEAD1△Ex5不影响HSC增殖。然而，在基础或TGFβ处理的人HSC中，共同沉默TM7SF3和TEAD1△Ex5可以消除TM7SF3 KD增强的细胞增殖作用（图三N）。以上数据表明，活性TEAD1通过HSC活化促进MASH的发展，并介导了TM7SF3 KD刺激的HSC活化和增殖作用。
图三 TM7SF3通过调节TEAD1选择性剪接来调节HSC活化[7]
AS的调节通常是通过剪接因子与前体mRNA序列的相互作用来实现的[12]。为鉴定TM7SF3 KD诱导TEAD1 AS的直接作用剪接因子，研究者分析与TM7SF3结合的蛋白质列表，寻找可能含有位于TEAD1外显子5上游或下游100 bp的RNA结合基序序列的剪接因子。如图四A所示，异质核核糖核蛋白U（hnRNPU）是唯一具有接近TEAD1外显子5临近结合基序的剪接因子。进一步验证hnRNPU与TEAD1前体mRNA的相互作用，在人HSC提取物中用hnRNPU和TM7SF3的抗体分别进行RNA免疫沉淀（RIP），设计位于TEAD1外显子5下游的引物检测TEAD1前体mRNA（图四B）。与免疫球蛋白G（IgG）对照组相比，hnRNPU和TM7SF3抗体沉淀显著富集了TEAD1前体mRNA（图四C）。此外，沉默人HSC中的hnRNPU减少了TM7SF3抗体拉下的TEAD1前体mRNA的量（图四D）。相比之下，当TM7SF3在人HSC中沉默时，与对照组相比，hnRNPU与TEAD1前体mRNA的结合没有受到影响（图四E）。推测hnRNPU与TEAD1前体mRNA的结合导致外显子5的跳跃，在人HSC中单独或一起使用siRNA对KD hnRNPU和TM7SF3进行检测。hnRNPU KD降低了TM7SF3 KD诱导TEAD1剪接成其活性形式的能力（图四F和G）。此外，TM7SF3和hnRNPU的共同沉默降低了TEAD1靶基因的表达（图四H）以及TM7SF3 KD单独诱导的HSC激活（图四I）。这些结果表明，TM7SF3与hnRNPU结合并抑制其促进TEAD1外显子5跳跃的活性（图四Ja）。当TM7SF3耗尽时，hnRNPU不再受到抑制，因此TEAD1△Ex5增加进而促进HSC活化（图四Jb）。最后，Ki67阳性细胞检测人HSC中的sihnRNPU抑制TM7SF3 KD促进细胞增殖的程度与siTEAD1△Ex5相同（图四K）。以上这些结果表明，hnRNPU与TEAD1前体mRNA结合，诱导了外显子5跳跃剪接（图四Jb）。
图四 TM7SF3通过结合hnRNPU剪接因子抑制TEAD1选择性剪接[7]
进一步评估TEAD1 AS对HSC活化和MASH进展的影响。研究者设计了一种反义寡聚体（ASO），靶向外显子5下游内含子5上的hnRNPU结合基序（ASO 56）（图五A）。用ASO 56或对照ASO处理人原代HSC 48小时，然后用TGFβ处理24小时。结果显示，TGFβ处理HSC增加了TEAD1△Ex5、TGFB1、ACTA2、TIMP1、Il-6和PDGFRB的表达；而用ASO 56预处理HSC会降低它们的表达（图五B），表明这种ASO方法靶向hnRNPU的有效性，也表明TGFβ增加TEAD1△Ex5表达的作用是通过hnRNPU介导的。hnRNPU与小鼠和人TEAD1前体mRNA的基序结合是相同的，因此，研究者还测试了ASO 56在小鼠中的作用。首先评估ASO 56对减少肝脏类器官纤维化程序的影响。在脂肪酸混合物诱导期间，每3天通过转染将ASO 56或对照ASO递送至肝脏类器官，发现ASO 56抑制了纤维化基因（图五C）和蛋白质表达（图五D和E）；静息HSC标志物Bambi的表达更多（图五C）；MCP1的基因和蛋白质表达降低（图五C-E）。
图五 靶向TEAD1前体mRNA的ASO使HSC失活[7]
注射到小鼠体内的ASO主要集中在肝脏中[13]。因此，研究者评估ASO 56在小鼠体内抑制TEAD1 AS的能力。单次注射ASO剂量（10 mg/kg；静脉注射），7天后收集肝细胞、NPC（去除HSC）和HSC的mRNA进行分析。尽管ASO 56不影响肝细胞或NPC中的TEAD1 AS，但是HSC中的TEAD1△Ex5减少了50%（图五F）。此外，与对照ASO相比，ASO 56降低了HSC中TEAD1靶基因Cyr61的基础表达（图五G）。原代小鼠HSC和NPC（去除HSC）以及肝细胞用ASO 56或对照ASO处理48小时，然后用TGFβ处理24小时。如图五H所示，ASO 56减少了外显子5跳跃，恢复到基础或对照状态。此外，ASO 56抑制了TGFβ诱导的Acta2和Col1a1的表达（图五H），且不影响TEAD1 AS或TGFβ诱导的肝细胞或NPC的Pai1或Il-6表达（图五I和J）。以上数据表明，靶向TEAD1前体mRNA的ASO可减少HSC活化。
最后，研究者评估ASO 56体内改善小鼠MASH表型的能力。从8周龄开始，雄性小鼠WD喂食6个月。在WD的最后2个月，小鼠接受五次静脉注射ASO 56或对照ASO（3 mg/kg）（图六A）。ASO 56处理不影响小鼠体重、肝脏质量或脂肪质量，降低了TEAD1靶基因Ctgf和Birc5的表达，而与MASH相关的Wwtr1表达增加不受影响（图六B-D）。此外，ASO 56降低了肝脏Tnfα表达（图六E）和IL-1β蛋白水平（图六F和H）。此外，与喂食NCD的小鼠相比，WD喂食并用对照ASO处理小鼠的HSC活化标志物PDGFRβ和α-SMA的表达显著增加；同时，ASO 56处理几乎完全逆转了这种诱导（图六F-H）。与这一结果相一致，ASO 56还使WD喂食小鼠的TIMP1表达正常化（图六I），降低了血液ALT水平（图六J），并减少了肝细胞衰老（图六K）。在WD 6个月后，ASO对照组小鼠出现了预期的纤维化程度；而在ASO 56处理的小鼠中，天狼星红染色和肝脏羟脯氨酸含量测量显示胶原蛋白含量显著降低（图六L和M）。以上数据表明，小鼠体内的ASO 56处理导致HSC纤维化减少，肝脏胶原沉积减少，具有抗MASH的作用。
图六 靶向TEAD1前体mRNA的ASO体内促使HSC失活[7]
综上所述，该研究发现核定位的七次跨膜蛋白TM7SF3的缺失会在肝脏类器官、人原代HSC和代谢功能障碍相关脂肪肝炎（MASH）小鼠体内加速HSC的活化，从而激活纤维化程序和HSC增殖。TM7SF3抑制Hippo通路转录因子TEAD1 的选择性剪接，促进表达活性较低的TEAD1形式。而敲除TM7SF3后，剪接因子hnRNPU的释放促进了TEAD1的选择性剪接，导致抑制性外显子5缺失，产生了更活跃的TEAD1△Ex5形式，加速MASH 中的HSC激活和肝纤维化。该研究揭示了TM7SF3在抑制Hippo通路、HSC活化和MASH引起的纤维化发展方面的新作用，提示靶向性抑制TEAD1活化形式的ASO疗法在治疗MASH诱导肝纤维化中的应用潜力。
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