技术分享：发现肿瘤免疫治疗新靶点CD300ld
免疫检查点阻断疗法在肿瘤治疗中取得了革命性进展。然而，相当比例的患者对治疗仅表现出轻微甚至无应答[1]。肿瘤微环境（TME）含有大量抑制免疫的髓系细胞群，在肿瘤发展和治疗耐受中发挥关键作用，是现有免疫治疗的严重阻碍。中性粒细胞是高度丰富且异质性的髓系细胞，是先天防御急性感染和炎症的第一道防线。在癌症和其他病理性慢性炎症中，中性粒细胞从骨髓中的释放异常增加。而这些中性粒细胞往往功能异常，特别是在晚期癌症中，表现出高水平的可塑性，直接或间接地促进了肿瘤发生[2, 3]。这种病理性激活的中性粒细胞表现出强大的免疫抑制活性，被命名为PMN-MDSCs，是小鼠和人类肿瘤发生中TME的关键成分[3, 4]。在肿瘤环境中，大多数中性粒细胞被证明是具有免疫抑制活性的PMN-MDSCs，它们促进多类型的肿瘤进展，导致对免疫治疗的不良反应[5]。肿瘤中同时存在着多种中性粒细胞的发育状态。PMN-MDSCs和经典中性粒细胞具有相同的骨髓来源和表面标志物，尽管它们的功能不同，还不能被很好地区分[3]。因此，亟需寻找与PMN-MDSCs招募和功能相关的关键分子，从而选择性靶向PMN-MDSCs进行肿瘤免疫治疗。
2023年9月，Nature期刊报道了一项肿瘤免疫治疗新靶点研究，发现CD300ld是PMN-MDSCs特异性表面标志物和关键免疫抑制受体，可促进肿瘤进展。CD300ld通过STAT3-S100A8/A9轴发挥作用，靶向性阻断CD300ld可重塑肿瘤免疫微环境，显示出抗肿瘤功效以及与抑制免疫检查点PD1的协同疗效[6]。
首先，为了寻找参与建立肿瘤免疫微环境的PMN-MDSCs表面标志物，研究者比较了肿瘤来源的髓系细胞和淋巴细胞的转录组。选择356个髓系细胞特异性高表达的膜蛋白基因，构建sgRNA文库，并转导至Cas9小鼠的造血干细胞和祖细胞，随后移植到经致死剂量辐照的野生型小鼠中，重建免疫系统。4周后接种B16-F10肿瘤细胞，成瘤后分离肿瘤和骨髓中的CD45+免疫细胞进行sgRNA深度测序（图一a）。与骨髓相比，靶向Itgam和Trem2的sgRNA在肿瘤部位表现为特异性耗竭（图一b和c），其中Itgam编码介导白细胞粘附和迁移的髓系细胞表面标志物[7]，Trem2编码病理诱导的免疫信号中枢[8]，证明了此筛选方法的有效性。在所有测试的膜蛋白中，CD300ld排名最前，Cd300ld sgRNA在肿瘤中显示出显著性耗竭（图一b和c），提示表达CD300ld的细胞被特异性募集到肿瘤部位。在正常小鼠中，CD300ld主要表达在免疫器官中，包括骨髓和脾脏；在免疫细胞群中，CD300ld表达仅限于髓系细胞，在中性粒细胞中高表达，且在巨噬细胞和单核细胞中低表达（图一d和e）。RT-qPCR和流式细胞术证实CD300ld在荷瘤小鼠的中性粒细胞中上调表达（图一f-h）。CD14被鉴定为区分PMN-MDSCs和中性粒细胞的表面标志物[9]。在B16-F10荷瘤小鼠中，中性粒细胞CD14+ 细胞比例显著增加，并且这些CD14+ 中性粒细胞比CD14- 中性粒细胞表达更高水平的CD300ld（图一i），进一步证明PMN-MDSCs比无肿瘤中性粒细胞表达更高水平的CD300ld。以上数据表明，CD300ld是中性粒细胞和PMN-MDSCs的表面标志物，并且其在肿瘤进展过程中被上调表达，可能具有肿瘤促进作用。
图一 CRISPR体内筛选鉴定出PMN-MDSCs表面标志物CD300ld有利于肿瘤进展[6]
接下来，研究者探究CD300ld在肿瘤进展中的作用，构建Cd300ld敲除（KO）小鼠，将B16-F10黑色素瘤细胞皮下注射到野生型和Cd300ld KO小鼠中。与野生型小鼠相比，Cd300ld KO小鼠的肿瘤生长显著减少，在接种后第16天肿瘤质量减少65%，显著提高了小鼠存活率（图二a和b）。在其他同源肿瘤移植小鼠模型中也得到了相似结果，包括TC-1、LLC、MC38和EL4肿瘤细胞系（图二c-f）。利用流体动力学注射肉豆蔻酰化的AKT1（myr-AKT）和NRAS（V12）的转座子表达质粒，可诱导小鼠肝细胞癌（HCC）造模[10]。发现Cd300ld KO显著抑制了HCC进展，肝脏与身体质量比降低约50%，显著延长小鼠的生存期（图二g）。以上数据表明，Cd300ld KO抑制了多种肿瘤模型的疾病进展。
图二 Cd300ld KO以PMN-MDSCs依赖的方式抑制肿瘤进展[6]
为了确定哪些CD300ld表达细胞调节肿瘤进展，研究者使用骨髓移植来重建受体小鼠的免疫系统，然后接种肿瘤细胞。当用Cd300ld KO供体骨髓细胞重建野生型受体小鼠时，肿瘤生长明显慢于野生型供体（图二h）。为了在髓系细胞包括巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞中特异性敲除Cd300ld，研究者构建Cd300ldfl/fl Lyz2cre小鼠，发现在髓系细胞条件性敲除Cd300ld显著抑制了肿瘤进展，与Cd300ld KO小鼠类似（图二i）。进一步缩小涉及细胞群体，将Cd300ldfl/fl小鼠与S100a8cre小鼠杂交，获得PMN-MDSCs特异性敲除Cd300ld小鼠，同样显著性抑制肿瘤生长（图二j），表明PMN-MDSCs是CD300ld促进肿瘤进展的主要细胞类型。用LY6G抗体处理荷瘤小鼠可以耗尽PMN-MDSCs，发现抗体处理在野生型荷瘤小鼠中具有显著的抗肿瘤作用，但在Cd300ld KO小鼠中没有（图二k），进一步证实CD300ld是PMN-MDSCs促进肿瘤进展所必需的，并且Cd300ld KO通过PMN-MDSCs抑制肿瘤进展。
研究者进一步阐明Cd300ld KO是否影响肿瘤免疫微环境。在B16-F10肿瘤模型中，Cd300ld KO显著减少了PMN-MDSCs向肿瘤的募集，同时CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的肿瘤浸润显著增加（图三a-c）。使用scRNA-seq分析肿瘤浸润的CD45+ 免疫细胞，鉴定出13种独特的细胞亚群，其中CD300ld主要在PMN-MDSCs中表达（图三d）。与野生型小鼠相比，大多数免疫抑制细胞群，包括髓系PMN-MDSCs、单核细胞髓系衍生抑制细胞（M-MDSCs）和巨噬细胞，以及淋巴调节T（Treg）细胞，在Cd300ld KO小鼠的肿瘤中表现出细胞数量减少，PMN-MDSCs减少最为显著。相反，抗肿瘤作用的细胞群数量增加，包括CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和NK细胞，表明Cd300ld KO显著改变了TME的细胞组成，从促肿瘤状态转变为抗肿瘤状态（图三e和f）。此外，Cd300ld KO显著下调中性粒细胞迁移，髓系细胞表现出炎症增加和抗炎基因表达显著降低（图三g）。Cd300ld KO小鼠TME中的CD8+ T细胞活化和迁移得分显著提高（图三h），与T细胞浸润增加一致，表明Cd300ld KO TME中的T细胞更具免疫活性。以上数据表明，Cd300ld KO将TME从免疫抑制状态重塑为免疫活化状态。
图三 Cd300ld KO重塑肿瘤免疫抑制微环境[6]
接着，研究者进一步确定CD300ld在PMN-MDSCs中的功能。使用RNA测序分析PMN-MDSCs的基因表达谱，发现Cd300ld KO显著降低了与中性粒细胞迁移途径相关基因的表达（图四a）。Transwell测定显示，与野生型PMN-MDSCs相比，Cd300ld KO PMN-MDSCs的迁移显著减少（图四b）。使用体内迁移竞争分析来剖析Cd300ld KO对PMN-MDSCs募集到肿瘤的影响，用Cell Trace Violet（CTV）标记PMN-MDSCs，分别产生CTV低的野生型和CTV高的Cd300ld KO细胞群，并将它们1:1混合注射到野生型荷瘤小鼠中（图四c）。两种PMN-MDSCs向骨髓的迁移是相似的，然而Cd300ld KO PMN-MDSCs在肿瘤部位的富集显著低于野生型PMN-MDSCs（图四d和e），表明CD300ld在PMN-MDSCs向肿瘤的迁移和募集中起着关键作用。此外，还发现Cd300ld KO PMN-MDSCs表现出ARG1表达显著减少，推测可能参与调节PMN-MDSCs的免疫抑制功能。为证实PMN-MDSCs的T细胞抑制活性是否受CD300ld的调节，研究者将PMN-MDSCs与OT-1脾细胞共培养，并用卵白蛋白（OVA）肽刺激。发现野生型PMN-MDSCs显著抑制OVA肽诱导的T细胞增殖，但Cd300ld KO PMN-MDSCs的抑制作用大大降低，表明Cd300ld KO消除了PMN-MDSCs的T细胞抑制活性（图四g和h）。进一步发现Cd300ld KO显著降低了CD14+ 细胞的T细胞抑制活性和迁移，但对CD14- 细胞的抑制活性和迁移几乎没有影响（图四i）。以上数据表明，CD300ld是PMN-MDSCs肿瘤迁移以及PMN-MDSCs介导的T细胞抑制所必需的.
图四 CD300ld通过S100A8/A9调节PMN-MDSCs的迁移和T细胞抑制活性[6]
为挖掘PMN-MDSCs中CD300ld的下游因子，研究者比较野生型和Cd300ld KO PMN-MDSCs的转录组数据，观察到S100A8和S100A9（以下统称为S100A8/A9）在Cd300ld KO后显著下调（图四j）。S100A8/A9主要由中性粒细胞和单核细胞表达和分泌，它们可在MDSCs中高水平积累，形成异二聚体，并在各种实体瘤和白血病中促进肿瘤进展和免疫逃逸[2]。在野生型小鼠中，S100A8/A9异二聚体的血清水平在荷瘤后显著增加；而在Cd300ld KO小鼠中没有显示出显著差异（图四k），表明S100A8/A9在Cd300ld的下游起作用。探究S100A8/A9在CD300ld介导的PMN-MDSCs迁移中的作用，发现与野生型PMN-MDSCs相比，S100A8/A9蛋白的添加显著增加了Cd300ld KO PMN-MDSCs中的迁移，导致两个细胞群之间的迁移率相似（图四l），表明S100A8/A9挽救了Cd300ld KO诱导的PMN-MDSCs迁移缺陷。用S100A9抑制剂他喹莫德处理荷瘤小鼠，显著降低了野生型小鼠中PMN-MDSCs向肿瘤的募集，降低到Cd300ld KO水平，且他喹莫德处理没有进一步降低Cd300ld KO PMN-MDSCs向肿瘤募集的水平（图四m）。经他喹莫德处理的野生型和Cd300ld KO小鼠的肿瘤生长相似（图四n），推测S100A8/A9也参与CD300ld介导的PMN-MDSCs抑制T细胞活性。为证实这一推测，研究者在OVA肽存在的情况下，将S100A8/A9蛋白添加到PMN-MDSCs与OT-1脾细胞的共培养中，发现它们恢复了Cd300ld KO PMN-MDSCs抑制T细胞活化的能力（图四o）；反之，他喹莫德将野生型PMN-MDSCs的T细胞抑制活性降低到与Cd300ld KO PMN-MDSCs相似的水平（图四p）。STAT3在调节MDSCs的分化和耐受作用中具有重要作用，并且可以被募集到S100a8和S100a9的启动子区域[11]。与野生型PMN-MDSCs相比，Cd300ld KO PMN-MDSCs表现出显著低水平的磷酸化STAT3（图四q）。STAT3抑制剂可将野生型PMN-MDSCs的迁移和T细胞抑制活性降低到与Cd300ld KO相似水平，且可以通过添加S100A8/A9来恢复（图四r和s）。以上数据表明STAT3在CD300ld的下游起调节S100A8/A9的作用。
随后，研究者检测Cd300ld KO对已建立的肿瘤生长的影响。构建Cd300ldfl /fl Mx1cre小鼠，在B16-F10接种后第7天，肿瘤达到约50 mm3时给与poly(I:C)处理以敲除造血细胞中的Cd300ld（图五a）。与Cd300ldfl /fl 对照小鼠相比，Poly（I:C）处理显著减少了Cd300ldfl /fl Mx1cre小鼠的肿瘤生长（图五b和c），表明在肿瘤建立阶段KO Cd300ld也可以抑制肿瘤进展。CD300ld是一种单跨膜蛋白，研究者测试是否有可能使用其细胞外结构域（ECD）竞争性阻断CD300ld。CD300ld-ECD-hFc的表达对体外B16-F10肿瘤细胞的生存能力没有显著影响，然而，当在肿瘤接种后第7天给予小鼠时，与对照处理相比，CD300ld-ECD-hFc显著抑制了肿瘤生长（图五d和e）。在Cd300ld KO小鼠中，CD300ld-ECD-hFc处理未观察到额外的肿瘤抑制作用（图五f）。PD1抑制T细胞的活化，CD300ld对于PMN-MDSCs抑制T细胞是必不可少的，提示PD1和CD300ld的双重阻断可能表现出更强的抗肿瘤功效。研究者在肿瘤接种后第7天用抗PD1处理野生型和Cd300ld KO荷瘤小鼠，发现抗PD1处理在野生型和Cd300ld KO小鼠中都产生了显著的肿瘤抑制作用，并显著提高了小鼠的存活率（图五j-l），表明抗PD1和CD300ld敲除具有协同作用。研究者还在荷瘤小鼠中评价CD300ld-ECD-hFc和抗PD1的联合效果，同样观察到协同作用，肿瘤抑制水平高于单一治疗（图五m-o）。以上数据表明，阻断CD300ld可以抑制已建立的肿瘤生长，并与抗PD1表现出协同作用，CD300ld可以作为增强检查点抑制剂疗效的治疗靶点。
图五 阻断CD300ld可抑制已建立的肿瘤生长并与抗PD1表现出协同作用[6]
最后，研究者探究CD300LD在人类癌症中的作用，观察到CD300LD特异性高表达在人类中性粒细胞（图六a），并在结肠癌或肺癌患者外周血的PMN-MDSCs具有更高的表达水平（图六b）。在黑色素瘤患者样本中，CD300LD与中性粒细胞标记物MPO和CD15共定位，且在癌组织中观察到比癌旁组织更高的表达（图六c和d）。癌症基因组图谱数据分析显示，CD300LD在多种肿瘤位点的表达相比癌旁和正常组织显著更高（图六e），CD300LD高表达显示出与皮肤黑色素瘤患者低生存率的显著相关性（图六f）。通过在Cd300ld的起始密码子处插入人CD300LD PolyA盒，构建了CD300LD人源化（huLD）小鼠。B16-F10和TC-1的肿瘤进展（图六g）、肿瘤浸润的PMN-MDSCs和CD8+ T细胞水平以及S100A8/A9异二聚体的血清水平（图六h和i）在HuLD和野生型小鼠中相似，表明人CD300LD在肿瘤促进中具有保守功能。在肿瘤接种后第7天用人CD300LD-ECD治疗huLD荷瘤小鼠，同样观察到肿瘤生长的显著减少和存活率增加（图六j）。以上数据表明，CD300LD的促肿瘤活性在小鼠和人之间是一致的，具有同功性，提示CD300LD是人类肿瘤免疫疗法的潜在靶点。
图六 CD300LD在人类癌症中具有保守功能[6]
综上所述，研究者在肿瘤小鼠模型中进行了体内CRISPR-Cas9筛选，发现CD300ld这个肿瘤偏爱受体的最佳候选者。CD300ld在正常中性粒细胞中特异性表达，并在携带肿瘤的PMN-MDSCs中上调表达。CD300ld是将PMN-MDSCs募集到肿瘤以及抑制T细胞活化功能所必需的，敲除后以PMN-MDSCs依赖的方式抑制多种肿瘤类型的进展。CD300ld通过STAT3-S100A8/A9轴发挥作用，敲除后可逆转肿瘤免疫抑制微环境。CD300LD同样在人类癌症中上调表达，并显示出与患者生存不利的相关性。阻断CD300ld活性可抑制肿瘤进展，并与抗PD1具有协同作用。该研究确定了CD300ld是PMN-MDSCs的关键免疫抑制受体，是肿瘤免疫耐受所必需的。此外，CD300ld靶点显示出广谱抗肿瘤效果，为肿瘤免疫疗法提供了新的潜在靶点，具有重要的临床转化意义。
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