技术分享：肝脏SAMe调控禁食适应性代谢反应
禁食有助于促进人类健康、延缓衰老和预防肥胖。禁食会触发包括肝脏、大脑和脂肪组织等主要器官系统的适应性代谢反应，该过程受到激素、生长因子和细胞因子组成的复杂网络所调控[1]。大多数哺乳动物禁食12-24小时会导致肝脏肝糖原储备减少，而增加脂肪来源的酮体和游离脂肪酸作为主要能量来源。这种肝脏的适应性代谢反应非常复杂，受到严格调控，包括葡萄糖、脂质和蛋白质代谢的变化。
有研究认为，蛋氨酸（Met）通路中的酶可能在禁食期间受到调节，以维持Met水平稳定[2]。Met在肝脏中通过Met腺苷转移酶（MAT）同工酶I和III代谢合成S-腺苷甲硫氨酸（SAMe）。MAT同工酶主要有3种：MATI、MATII和MATIII。MATI和III的催化亚基（MAT1A）由主要在肝脏中表达的Mat1a基因编码，而MATII的催化亚基（MAT2A）由广泛表达的Mat2a基因编码[3]。SAMe参与肝脏的多胺生物合成、谷胱甘肽（GSH）合成以及甲基转移作用，例如作为磷脂酰乙醇胺（PE）转化为磷脂酰胆碱（PC）的甲基供体。多项研究指出Met循环在维持脂质稳态中发挥重要作用。Met限制饮食（MRD）的啮齿动物表现出肝脏Met和SAMe水平降低、寿命延长、体重增加减缓和胰岛素敏感性增加，并且不会发生肝脏脂肪变性[4]。在人类中，血浆SAMe水平随着体重指数的增加而增加[5]。禁食期间，肝脏SAMe水平下降，而Met水平保持不变，表明在饥饿条件下肝脏SAMe的利用率提高[6]。以上研究提示了一种可能性，SAMe水平的调节，而不是Met本身，可以调节进食/禁食状态下的脂质稳态。然而，这种SAMe响应身体对禁食的代谢反应发生了何种变化，及其发挥何种重要功能仍未可知。
2023年8月，Cell Metabolism期刊上揭示了肝脏SAMe在调节禁食代谢反应中的关键作用。SAMe作为营养的代谢传感器，通过调节肝脏的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶（PEMT）活性、内质网-线粒体接触、β氧化和ATP产生，以及FGF21介导的脂肪组织脂解和产热，来调节禁食代谢反应。禁食期间，胰高血糖素促进肝脏SAMe合成酶蛋氨酸腺苷转移酶α1（MAT1A）的表达增加，使得SAMe在线粒体相关膜（MAMs）区域被合成，起到刹车的作用，防止过度的β氧化和线粒体ATP合成，最终缓解内质网应激和肝脏损伤[7]。
首先，研究者对小鼠禁食后肝脏Met、SAMe和S-腺苷-L-同型半胱氨酸（SAH）水平进行详细的时间进程研究，发现肝脏SAMe水平早在禁食6小时显著下降，同时甲基转移后形成的副产物SAH水平升高，导致SAMe/SAH比率降低，而Met水平较为稳定（图一A）。当小鼠维持5天的60%热量限制时，也出现类似结果（图一B）。肝脏中的SAMe主要由MAT1A合成，禁食后Mat1a mRNA和MAT1A蛋白表达从12小时到24小时逐渐增加，并在36小时保持增加（图一C和D）。同样，在维持5天60%热量限制的小鼠中，Mat1a mRNA和MAT1A蛋白水平也显著增加（图一E）。糖皮质激素如曲安奈德和地塞米松已被证明可诱导Mat1a的表达[8]，研究者测试胰高血糖素是否也有相同作用。实验发现，原代肝细胞培养物经胰高血糖素处理12小时和16小时后，Mat1a mRNA和蛋白质水平也都显著上调（图一F）。禁食过夜的野生型（WT）小鼠经胰高血糖素处理30分钟，肝脏Mat1a mRNA水平就开始有所升高，但这种效果在缺乏胰高血糖素受体的Gcgr-KO小鼠中不发生[9]（图一G）。以上数据表明，禁食诱导肝脏SAMe合成酶Mat1a表达上调，且该过程可被胰高血糖素调控；同时SAMe水平减少，且SAH水平升高，提示食物限制时尽管SAMe的合成增加，但其使用显著增强。
图一 食物限制导致肝脏SAMe的使用增加[7]
接下来，研究者利用MAT1A-KO小鼠模型探讨肝脏MAT1A在脂质代谢中的作用。MAT1A-KO小鼠的特点是肝脏存在明显的高蛋氨酸血症和慢性SAMe缺乏，8月龄时发展成大泡性脂肪变性，过半小鼠在18月龄发展为肝细胞癌[10]。实验发现，MAT1A-KO幼仔的死亡率增加，只有54.8%的幼仔可以存活到断奶（图二A）。此外，MAT1A-KO小鼠的体重从21日龄到90日龄持续下降（图二B）。50-60日龄的WT和MAT1A-KO小鼠的夜间和日间食物摄入相似，表明食物摄入减少不是MAT1A-KO小鼠体重降低的原因（图二C）。研究者还发现MAT1A-KO小鼠的能量消耗（EE）显著增强（图二D），运动活性略有下降（图二E）。MRI分析45-55日龄雄性小鼠，发现MAT1A-KO小鼠的脂肪含量较低（图二F），腹股沟白色脂肪组织（ingWAT）/体重的比值显著减少（图二G），脂肪细胞变小（图二H）。MAT1A-KO小鼠Ucp1 mRNA和蛋白质水平表达上调（图二I和J），以及异丙肾上腺素刺激后的脂肪分解反应增强（图二K），表明ingWAT褐变迹象增加。MAT1A-KO小鼠的棕色脂肪组织（BAT）显示出多房脂滴变小（图二L），Ucp1 mRNA和蛋白质表达增加（图二M和N）。在室温或在急性冷暴露（4℃）下，MAT1A-KO小鼠的肩胛间BAT表面温度显著升高，表明产热增强（图二O）。MAT1A-KO小鼠肝脏的不完全和完全脂肪酸氧化增加（图二P），但不伴随肝损伤（图二Q）。以上结果表明，MAT1A缺失引起肝脏SAMe的慢性缺乏，即使在进食条件下，也会导致分解代谢过度的状态，最终引起小鼠出生后死亡率增加，提示SAMe水平的持续下降可以作为食物限制的代谢传感器来诱导代谢反应。
图二 肝脏MAT1A缺失增加体重减轻、能量消耗和出生后死亡率[7]
研究者进一步探索MAT1A-KO小鼠对禁食的反应。对出现脂肪变性前的50-60日龄小鼠进行禁食36小时处理，发现无论雌雄，MAT1A-KO小鼠在禁食期间的体重减轻都比WT小鼠更明显（图三A）。禁食导致MAT1A-KO小鼠的脂肪含量降低（图三B-D），能量消耗增强（图三E），BAT多房脂滴变小（图三F），UCP1蛋白水平增加（图三G），肝脏不完全脂肪酸氧化增加（图三H），分离出的肝细胞在基础和胰高血糖素处理条件下产生更多的ATP（图三I）。随后，研究者从禁食24小时的MAT1A-KO小鼠中分离出肝细胞，显示出基础肝细胞耗氧率（OCR）、ATP相关呼吸、最大呼吸和非线粒体耗氧量的增强，而补充SAMe可以消除这些反应（图三J）。SAMe处理还阻断了MAT1A-KO肝细胞中脂肪酸氧化活性的增强（图三K）。MAT1A-KO小鼠在禁食24小时后出现了肝损伤和内质网应激（图三L和M）。MAT1A-KO小鼠的40%热量限制喂养2个月或隔日禁食（ADF）也诱导出现内质网应激（图三N和O）。以上数据表明，禁食诱导MAT1A缺失小鼠过度激活脂肪组织的动员和使用，以及肝脏β氧化和ATP的产生，最终导致内质网应激和肝脏损伤。
图三 MAT1A缺乏会恶化禁食期间的体重减轻并造成肝脏损伤[7]
FGF21主要在肝脏中表达，在饥饿和蛋白质限制引起的代谢反应中发挥核心作用，主要体现在诱导肝脏脂肪氧化、生酮和糖异生、脂解、WAT褐变以及改善葡萄糖耐受等方面[11]。实验发现，MAT1A-KO小鼠不管在喂食还是禁食的条件下，血清FGF21和肝脏Fgf21 mRNA水平都显著升高（图四A和B）；同时，位于Fgf21转录起始位点（TSS）下游的CpG位点（#10–#15）的DNA甲基化水平显著降低（图四C和D）。进一步在MAT1A-KO小鼠肝脏内敲降Fgf21，可以有效降低血清FGF21水平的升高（图四E），缓解禁食期间的体脂和ingWAT重量减轻、脂肪细胞变小和能量消耗增强的表型（图四F-I），而肝脏β氧化、内质网应激和肝脏损伤表型没有改善（图四J-L）。以上结果表明，肝脏MAT1A缺失诱导了FGF21启动子低甲基化，增加了FGF21的肝脏合成和分泌，进而增强能量消耗。
图四 MAT1A缺失降低FGF21启动子甲基化，增加FGF21循环水平和能量消耗[7]
随后，研究者使用核磁共振（NMR）光谱进行代谢流组学实验，追踪13C标记的Met与其他细胞代谢物的相互作用。给禁食24小时的小鼠在检测前30分钟静脉注射13C标记的Met。发现在MAT1A-KO小鼠的肝裂解物中，13C标记的SAMe、高半胱氨酸、高丝氨酸、乳酸和1,6-二磷酸果糖代谢物减少，而13C标记的Met、3-磷酸甘油、葡萄糖-6磷酸和葡萄糖增加（图五A和B），表明禁食期间MAT1A缺失促使Met的代谢通量从SAMe合成向葡萄糖合成转移。通过基于31P NMR的磷酸化蛋白质组学[12]测量PC和PE的总含量，发现24小时禁食的MAT1A-KO小鼠肝脏中PC和PC/PE比率明显下降（图五C）。PC合成途径之一涉及到肝脏磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶（PEMT）对PE的三甲基化，该反应需要三个SAMe分子，PEMT的减少导致PC/PE比率显著降低，导致线粒体呼吸和ATP产生增加[13]。研究者推测在禁食MAT1A-KO小鼠中观察到的β氧化、ATP合成、内质网应激和肝脏损伤的增强可能是由于PEMT活性降低所致。于是，在禁食36小时之前对肝脏PEMT进行急性敲降，发现敲降小鼠的肝脏Pemt基因表达显著降低（图五D），肝脏PC含量和PC/PE比值下降（图五E）。但是Pemt敲降没有导致明显的体重（图五F）和ingWAT质量（图五G）减轻，也没有导致Fgf21 mRNA或蛋白质表达增强（图五H）。相反，禁食期间的Pemt敲降诱导了肝脏β氧化（图五I），并伴有内质网应激和肝脏损伤增加（图五J和K）。以上数据表明，在禁食期间，Met循环流向SAMe和PC合成，其中SAMe水平对于PEMT调节具有重要作用；禁食后减少的SAMe将导致PC/PE比值下降，出现内质网应激和肝脏损伤。
图五 禁食期间蛋氨酸循环流向SAMe和PC合成[7]
内质网向线粒体释放Ca2+，推动了线粒体β氧化。在禁食期间，内质网的特定区域可逆地与线粒体相连，促进这种Ca2+流动。这些接触点被称为线粒体相关膜（MAMs）。研究者使用透射电子显微镜（TEM）检测内质网和线粒体之间的接触程度，发现与WT小鼠相比，在喂食和禁食条件下，MAT1A-KO肝细胞的线粒体和内质网之间的接触比例显著提高（图六A和B），表明肝脏SAMe水平的降低有利于内质网-线粒体接触点的形成，促进Ca2+向线粒体转移和线粒体呼吸。PEMT主要位于MAMs，在禁食期间发挥作用，维持PC合成和磷脂酰丝氨酸（PS）进入线粒体（图六C）[14]。因此，禁食后MAT1A-KO小鼠的SAMe降低，也会降低MAMs中PEMT活性，导致PC/PE降低（图六C）[13]。于是研究者推测在禁食过程中，MAT1A蛋白的合成区域可能与PEMT所在的内质网MAMs区域相近，从而区室化产生其活性所需的SAMe（图六C）。事实发现24小时禁食、隔日禁食、急性或慢性热量限制都会导致细胞器中MAT1A蛋白的增加（图六D和E）。通过差速离心进行亚细胞分级，从新鲜肝组织中获得MAMs、内质网以及粗的和纯的富含线粒体（MP）的级分，发现在禁食6小时后，在MAMs中检测不到MAT1A蛋白，但在禁食16-24小时后高度富集（图六F）。在禁食的MAT1A-KO小鼠的MAMs中未检测到MAT1A（图六G）。最后，研究者测量小鼠的总肝脏提取物和粗线粒体提取物（包括MAMs和线粒体）中的SAMe，发现禁食不会改变WT和MAT1A-KO小鼠的总肝匀浆SAMe水平（图六H），但是禁食24小时MAT1A-KO小鼠的粗线粒体提取物中SAMe水平显著较低（图六I）。以上数据表明，食物缺乏或食物限制会导致SAMe在MAMs中的区室化合成，这种重要机制可以平衡食物缺乏导致的SAMe水平整体降低，防止过度的β氧化和内质网应激，从而防止肝损伤。
图六 禁食期间MAT1A定位于MAMs[7]
综上所述，该研究揭示了肝脏SAMe在禁食适应性代谢反应中发挥的关键作用，禁食期间肝脏SAMe水平的生理性降低通过微调肝脏线粒体相关膜（MAMs）的相互作用、β氧化和ATP合成，起到营养代谢传感器的作用。肝脏SAMe水平的长期降低会诱导FGF21启动子低甲基化，增强FGF21合成和分泌，从而促进白色和棕色脂肪组织的脂质分解代谢并增加能量消耗。尽管SAMe水平总体下调，但在禁食期间，MAMs中的MAT1A蛋白表达增加，造成SAMe区室化合成，这对于维持PEMT活性以及PC/PE比例发挥了关键作用，限制了线粒体β氧化和ATP合成的速率，最终缓解内质网应激和肝脏损伤。
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