技术分享：Mas激活可增强脂噬和脂肪酸氧化，改善小鼠药物性肝损伤
药物性肝损伤（DILI）是指在正常治疗或临床试验剂量范围内的药物使用过程中，因药物本身或其代谢产物引起的程度不同的直接或间接的肝脏损害。DILI是全球主要的健康问题，也是急性肝功能衰竭（ALF）的最常见原因[1]。其中，对乙酰氨基酚（APAP）过量是药物诱导ALF的主要原因，其特征是小叶中心坏死和转氨酶水平显著升高。APAP是研究最广泛的肝毒性药物，其毒性主要是由于过量服用后的反应性代谢产物N-乙酰基对苯醌亚胺（NAPQI）迅速消耗谷胱甘肽（GSH），损害线粒体功能，并诱导核DNA损伤。肝细胞死亡随后激活库普弗细胞并诱导外周免疫细胞的肝脏浸润，进一步加重肝脏损伤[2]。
自噬是细胞吞噬和降解受损细胞器和细胞质大分子的过程，为随后的细胞代谢提供ATP和底物。它是一种广泛存在于真核细胞中的循环再利用系统，通常在细胞应激时上调。脂噬（lipophagy）是一种特殊类型的自噬，它选择性地识别脂滴（LD），将其有效地整合到自噬体中，以降解甘油三酯（TG）并释放出游离脂肪酸（FFA），从而为脂肪酸氧化（FAO）提供底物。据报道，在APAP诱导的肝毒性中，增强的自噬通过去除受损线粒体和APAP蛋白加合物来减少活性氧的产生，起到保护的作用[3]。
Mas是一种G蛋白偶联受体，由癌基因Mas1编码。Mas在人类和小鼠组织中广泛表达，尤其富集在单核细胞-巨噬细胞和神经系统[4]。Mas参与自噬和脂质代谢。Mas的激活通过抑制PI3K-Akt mTOR信号通路诱导自噬，并通过调节脂质代谢减少活性氧的产生[5]。在肝脏中，Mas激活的保护作用已在非酒精性脂肪变性、炎症和纤维化中得到证明[4, 6, 7]。然而，Mas在DILI中的作用仍有待阐明。
2023年3月，Journal of Hepatology期刊上报道了一项Mas激活保护肝脏免受药物性损伤的作用机制研究。具体而言，肝细胞特异性Mas信号的激活可通过增强脂噬和FAO来减轻APAP诱导的肝毒性，而这两种作用都依赖于AKT信号通路的抑制和FOXO1信号通路的激活。该研究提示Mas-AKT/FOXO1脂肪酸降解途径可能对制定APAP过量的治疗策略至关重要[8]。
首先，研究者探究人和小鼠DILI的肝内Mas表达情况。免疫组织化学染色（IHC）显示，与健康对照组相比，DILI病人的肝内Mas显著上调（图一A）；Mas在DILI病人的肝实质细胞和非实质细胞中广泛表达，包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肝星状细胞和内皮细胞（图一B）。同样的，不同剂量的APAP处理后的小鼠肝内Mas的表达也显著上调（图一C和D）；小鼠的多种组织和细胞类型也广泛表达Mas（图一E）。以上数据表明，Mas可能参与DILI进程。
图一 人和小鼠DILI的肝内Mas表达上调[8]
接下来，研究者探索Mas在小鼠体内的作用，用300 mg/kg的APAP处理Mas1-/-和野生型（WT）小鼠，24小时后进行疾病表型分析。发现与对照小鼠相比，Mas1-/-小鼠肝细胞死亡和炎症浸润明显，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平显著升高（图二A和B），表明Mas1-/-小鼠对APAP具有明显的不耐受性。当用致死剂量的APAP处理时，Mas1-/-小鼠的存活率显著降低（图二C）。蛋白质印迹（WB）显示，Mas1-/- APAP小鼠肝脏中炎症（IL-1β）、线粒体应激（p-JNK）和细胞死亡（Cl-cas3、Bax）标志物的蛋白表达水平均显著升高（图二D）。KEGG通路富集分析显示，Mas1-/- APAP小鼠肝脏特异性高表达的基因主要富集在凋亡、坏死、铁死亡和炎症相关通路（图二E）。使用数字自适应光学扫描光场相互迭代断层扫描（DAOSLIMIT）直观地监测活体小鼠的肝内炎症细胞，显示Mas1-/- APAP和WT-APAP组的中性粒细胞活性显著增强，数量显著增多（图二F）。以上数据表明，全身性Mas1缺失加剧了APAP诱导的小鼠肝脏毒性。
图二 全身性Mas1缺失加剧APAP诱导的小鼠肝毒性[8]
随后，研究者进一步探究全身性Mas1缺失加剧APAP诱导小鼠肝毒性的机制。将Mas1-/- APAP和WT-APAP组小鼠肝脏分别进行转录组、蛋白质组、代谢组测序，经KEGG分析， Mas1-/- APAP组特异性表达的mRNA和蛋白质对（图三A）、mRNA（图三B）和代谢物（图三C）都富集在自噬和脂肪酸降解这两种通路上。热图也显示Mas1-/- APAP组相比WT-APAP组，出现脂肪酸降解和自噬通路的下调以及脂滴形成相关通路的上调（图三D）。于是，研究者推测在APAP过量的情况下，Mas1缺失通过AKT-FOXO1下调自噬和脂肪酸降解，并对此进行验证。第一，WB分析相应标志物的蛋白质表达，相比WT-APAP组，Mas1-/- APAP组小鼠肝内的LC3-II、ATG7、LAMP1减少以及P62积累，表明自噬受损；ATGL、ACOX1和CPT1A减少，表明脂解和FAO受损，以及AKT增强和FOXO1抑制（图三E）。第二，透射电子显微镜（TEM）检测到Mas1-/- APAP小鼠的自噬液泡（AV）数量显著减少（图三F和G）。第三，免疫荧光显示，Mas1-/- APAP小鼠肝内的脂滴显著积累，脂噬和脂解减少（图三H-J）。第四，Mas1-/- APAP小鼠的TG水平显著升高（图三K）。以上数据表明，Mas1-/- 小鼠对APAP处理表现出的不耐受性可能源于脂噬和FAO不足，该过程可能受到AKT和FOXO1信号通路的调控。
图三 全身性Mas1缺失在APAP诱导的小鼠肝毒性中削弱脂噬和FAO[8]
接下来，研究者使用Mas激活剂AVE0991进行研究。发现AVE0991的预给药对WT-APAP小鼠产生了显著的保护作用（图四A和B）；显著提高了WT-APAP小鼠的存活率（图四C），显著减轻了肝内炎症、细胞死亡和线粒体应激（图四D）。此外，DAOSLIMIT显示AVE0991使得APAP处理的小鼠肝脏的浸润性中性粒细胞数量和迁移速度下降（图四E）。随后，研究者重点研究肝内脂噬和FAO，以探索AVE0991作用的潜在机制。数据显示，AVE0991显著上调WT-APAP小鼠的自噬（图四F）和脂噬（图四G）以及伴随着相应标志物蛋白质的表达（图四H），表明AVE0991挽救了自噬、脂噬和FAO，以及抑制AKT和增强了FOXO1信号传导。KEGG分析显示，与WT-APAP小鼠相比，AVE0991处理组小鼠的脂肪酸降解和自噬增强，而脂滴形成的途径受到抑制（图四I）。代谢组学分析发现AVE0991处理可显著增加三酰基甘油（TAG）的中性脂质产物单酰基甘油（MAG）和磷脂酰乙醇胺（PE）的水平，后者是一种与自噬密切相关的磷脂（图四J）。靶向脂质组学进一步定量肝内TAG、二酰基甘油（DAG）、FFA和PE成分（图四K和L），提示AVE0991可能促进TAG的降解，从而为随后的FAO释放FFA。研究者通过将[U-13C]-棕榈酸转化为13C标记的酰基肉碱和乙酰辅酶A来确定脂肪酸的代谢通量（图四M）。结果显示，AVE0991显著增加了体内脂肪酸转换，表现为肝内13C标记的棕榈酰肉碱（C16）、肉豆蔻酰基肉碱（C14）和月桂酰基肉碱（C12）以及乙酰辅酶A的丰度升高（图四N-P）。以上数据表明，激活的Mas通过增强脂噬和FAO保护小鼠免受APAP过量的肝毒性损伤。
图四 Mas激活诱导脂噬和FAO改善APAP诱导的小鼠肝毒性[8]
进一步，研究者确定APAP处理后脂噬和FAO在Mas信号传导中的作用。通过体内给予自噬诱导剂雷帕霉素（RAPA）、PPARa激动剂非诺贝特或泛PPAR激动剂拉尼兰诺以确定它们是否可以逆转Mas1-/- APAP小鼠的疾病表型，其中PPAR信号通路是参与FAO的关键酶的主要调节因子。结果显示，三者给药都显著减轻了APAP诱导的肝毒性（图五A和B）。RAPA给药显著增强了Mas1-/- APAP小鼠肝内指示自噬、脂解和FAO的蛋白质表达（图五C）以及增加了AV数（图五D），导致TG（图五B）和脂滴显著降低降低（图五E）。此外，Mas1-/- APAP小鼠中非诺贝特或拉尼兰诺给药诱导脂噬和FAO的持续增强（图五F）伴随着AV数的显著增加（图五D），表明自噬和FAO途径之间存在相互依赖性。
图五 在APAP诱导的小鼠肝毒性中，脂噬和FAO在Mas通路下游关键发挥作用[8]
PPARα是调控编码过氧化物酶体和线粒体FAO酶基因表达的核受体，研究者由此构建Mas1-/- Ppara-/- 小鼠，以探索Mas信号传导中脂噬和FAO之间的上下游关系。与Mas1-/-小鼠相比，Mas1-/- Ppara-/-小鼠中的RAPA的保护作用显著减弱（图五G），表明FAO在脂噬的下游发挥作用。给予WT-APAP小鼠自噬拮抗剂氯喹（CQ）、AVE0991和非诺贝特（图五H），发现CQ显著降低了AVE0991的保护作用，随后的非诺贝特给药显著逆转了CQ的有害作用（图五I和J），表明自噬在FAO的上游。一致地，肝内TG含量（图五J）随着脂噬活性（图五K）的改变而变化。此外，Ppara-/-小鼠中，AVE0991对APAP的保护作用显著减弱（图五L）。以上数据表明，在Mas信号传导中，脂噬产生的脂肪酸作为增强下游FAO的底物。研究者还分别小鼠给药p-AKT抑制剂哌立福新、FOXO1抑制剂AS1842856和去乙酰化酶抑制剂西尔替诺，证明了APAP处理后，Mas可能通过负调控的AKT和FOXO1信号通路调节脂噬和FAO。
最后，研究者通过腺相关病毒递送shRNA至小鼠体内构建肝内Mas1敲降小鼠shMas1（图六A-E），同时构建肝细胞特异性Mas1敲除小鼠AlbcreMas1f/f（图六F-I），实验证明肝内和肝细胞内Mas1缺失加剧了APAP诱导的小鼠肝毒性，表明肝细胞Mas信号在该进程中的关键作用。而APAP处理WT小鼠后2小时给药AVE0991激活Mas，可以显著改善疾病表型，恢复受损的自噬和脂肪酸降解（图六J-L）。
图六 肝内和肝细胞Mas1缺失加剧APAP诱导的小鼠肝毒性[8]
综上所述，该研究阐明了Mas在DILI中的作用，使用不同的遗传操作技术，构建了全身性、肝特异性和肝细胞特异性Mas1缺失小鼠，证明这些小鼠易受APAP诱导的肝毒性影响，表现出明显受损的脂噬和下游FAO抑制，同时伴随着上游AKT的激活和FOXO1的抑制。而肝细胞Mas的激活可增强AKT-FOXO1依赖的脂噬和FAO，保护小鼠改善APAP诱导的肝毒性。该研究结果为治疗APAP过量患者提供了新的线索，提示Mas有望成为治疗APAP诱导肝损伤的一个新靶点。
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