技术分享：肝脏特异性CRISPR递送系统——响应CES1释放的阳离子共聚物
基因组编辑系统已成为生物医学研究、基因药物开发和基因治疗的基础[1]。其中，CRISPR/Cas9系统由于其简单、灵活，在疾病治疗策略的研究中显示出巨大优势。然而，如何将CRISPR/Cas9系统安全、有效地递送和释放到靶器官、细胞和细胞核中，仍然是该系统应用于疾病治疗的一个主要挑战。脂质体、无机纳米颗粒和聚合物在CRISPR/Cas9系统的递送中展现出优势[2]。其中，聚合物因其制备简单、工艺可控，具有多种药物递送能力，如小分子、生物大分子和蛋白质，被认为是优秀的递送载体，可递送CRISPR/Cas9系统的不同组分形式，如Cas9-mRNA/sgRNA、质粒和核糖核蛋白。随着可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合的出现，阳离子共聚物因其高荷载潜力以及通过静电作用的细胞摄取能力，已被成功用于siRNA递送[3]。但是，由于阳离子会干扰细胞膜完整而造成细胞毒性，至今几乎没有阳离子聚合物纳米材料被FDA批准用于临床。因此，设计合成无害的阳离子聚合物递送系统仍旧是个难题。
2023年4月，Advanced Science上报道了一种用于体内外递送Cas9-mRNA/sgRNA的新型阳离子共聚物mPEG-b-P(Met/n-PMA），简称为PEG-PMet。该阳离子共聚物是由二甲基双胍衍生物、甲基丙烯酸丙酯在预聚物上共聚制成的三元共聚物，可以响应肝脏羧酸酯酶CES1有效地释放RNA，以进行基因组编辑。研究者选择PCSK9靶点进行应用测试，成功使用PEG-PMet递送Cas9-mRNA/sgPCSK9，使其在小鼠肝脏中有效积累，抑制PCSK9表达，降低小鼠血清中20%的低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平，改善高脂血症[4]。
二甲双胍是治疗2型糖尿病的一线药物，这种阳离子药物已被证明具有治疗有效性和良好安全性[5]。胍基聚合物可通过Gu+/PO34−的静电和氢键相互作用，易于粘附到核酸上[6]。然而，这些相互作用增强了胍基和核酸之间的稳定性，通常导致细胞内释放不理想，使得递送效率低下[7]。羧酸酯酶（CES）是一种酯酶家族成员，可将羧酸酯水解为相应的醇和羧酸。CES1和CES2是参与外源代谢的两种主要羧酸酯酶，具有一定的序列同源性，但表现出不同的组织分布和底物特异性[8]。CES1在肝脏中大量表达，而CES2主要表达在小肠和结肠。因此，研究者猜测如果在阳离子共聚物中加入CES1催化的丙酯单体，可能有助于解决细胞内的释放不良，同时实现肝脏的特异性释放。
首先，研究者设计合成了mPEG-b-P(Met/n-PMA），简称为PEG-PMet（图一A和B），并对其进行表征。透射电子显微镜（TEM）显示其大小约为30-50 nm（图一C）；对羧酸酯酶（CES）表现敏感，可被肝脏CES1体外降解（图一D）。
图一 PEG-PMet的合成与表征[4]
接着，研究者探究PEG-PMet和RNA的自组装情况。使用分子动力学（MD）模拟方法模拟两者的形成过程，两种分子在8：1的比例下可在100 ns后自组装成球形颗粒（图二A和B）。均方根偏差（RMSD）的变化显示，RNA分子在整个模拟过程中相对稳定； 而PEG-PMet在模拟开始时发生了显著变化，随后趋于稳定（图二C）。GROMACS能量计算显示，随着PEG-PMet和RNA的连续聚集，静电和范德华能量增强，两者之间的氢键数量增加，而RNA与水之间的氢键数目减少（图二D-F和H），表明氢键是二者聚集的主要驱动力。TEM显示PEG-PMet/RNA复合物的大小为20-30 nm（图二B），小于单一的PEG-PMet，提示稳定相互作用力的数量增加赋予了PEG-PMet较高的RNA凝聚能力。凝胶电泳和紫外光谱显示，两者在3：1的比例下可有效负载RNA（图二G），包装率高于70%（图二I）。包装在PEG-PMet中的RNA一周内仍保持稳定没有被降解，且在不同温度下均具有稳定性（图二J）。将CES1添加到PEG-PMet/RNA中，可检测到RNA的释放（图二K）。
图二 表征PEG-PMet的RNA负载与释放能力[4]
接下来，研究者测试PEG-PMet的细胞递送情况，选择具有高CES1活性的HepG2细胞进行测试，同时与阳离子脂质体Lipo3000进行比较。PEG-PMet可实现GFP mRNA较高的细胞递送，效率高于Lipo3000（图三A和B）。进一步将Cy5标记的sg PCSK9（Cy5-sgPCSK9）和含有核定位信号（NLS）的Cas9 mRNA包装入PEG-PMet（图三C），可观察到有效的细胞递送，且Cas9/sgRNA分布在细胞核内及其周围（图三D）。CCK8细胞毒性测试结果显示Lipo3000具有细胞毒性，而PEG-PMet可促进细胞活力（图三E），并且这种促进作用随着PEG-PMet剂量的增加而增加，即使500 μg/ml的剂量也没显示出细胞毒性（图三F）。以上结果表明，PEG-PMet可以实现细胞内的有效递送，且无细胞毒性。
图三 PEG-PMet的细胞内递送[4]
随后，研究者进一步测试PEG-PMet细胞递送CRISPR/Cas9系统的基因编辑情况，选择敲低PCSK9靶点来改善高脂血症（图四A）。高通量测序（图四B）和T7E1测定（图四C）表明，PEG-PMet/Cas9-mRNA/sgPCSK9诱导了HepG2细胞中PCSK9基因的有效编辑；显著下调了PCSK9蛋白表达（图四D和E），上调了低密度脂蛋白受体（LDL-R）表达（图四F-K）；促进细胞对外源性胆固醇的摄取，总胆固醇水平和细胞内脂滴均增多（图四L-N），表明PEG-PMet细胞递送的基因编辑成功。
图四 PEG-PMet/Cas9-mRNA/sgPCSK9介导细胞的基因组编辑[4]
最后，研究者测试PEG-PMet体内递送CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率，小鼠高脂饮食后接受单剂量尾静脉注射治疗（图五A）。发光成像结果显示，注射后0.5小时可在肝脏中观察到Cy5强荧光信号；相比Cy5对照组的快速代谢，两个PEG-PMet递送组的信号维持更持久且肝脏特异（图五B）。血清生化检测显示，PEG-PMet和Lipo3000递送的Cas9-mRNA/sgPCSK9实验组均能降低小鼠PCSK9水平、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和总胆固醇（TC）水平（图五C）。此外，甘油三酯（TG，图五C）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）和肌酸酐（S-Cr）水平（图五D）没有显著变化，表明这些疗法未对小鼠产生不良影响。WB结果也显示了治疗组小鼠的肝脏PCSK9水平降低，以及LDL-R水平升高（图五E）。以上结果表明PEG-PMet可实现小鼠肝脏特异性递送Cas9-mRNA/sgPCSK9，并完成有效的在体基因组编辑。有趣的是，研究者意外发现PEG-PMet相比Lipo3000的递送方式，还具有二甲双胍降低血糖的功效，显著降低了GTT和ITT水平（图五F），缓解了小鼠的胰岛素抵抗。
图五 PEG-PMet/Cas9-mRNA/sgPCSK9治疗可改善小鼠高脂血症[4]
综上所述，研究者设计合成的新型mPEG-b-P(Met/n-PMA）共聚物，通过静电和范德华力相互作用稳定地包裹核酸，可被肝脏CES1选择性地裂解激活，实现肝脏特异性的核酸递送。利用该共聚物，研究者实现了小鼠肝脏中PCSK9的有效基因组编辑，改善高脂血症，同时还具有降低血糖的作用。该研究建立了一种新的递送方式，实现CRISPR/Cas系统各成分的稳定负载、安全递送和定点释放，提供了一种新的设计思路，拓展了CRISPR/Cas9系统的应用。
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