技术分享：肿瘤细胞外囊泡和颗粒导致肝脏代谢功能障碍
癌症是一种系统性疾病，可由其释放的可溶性因子如细胞外囊泡和颗粒（EVP）介导，改变其他无转移器官的功能[1, 2]。原发性肿瘤来源的EVP可在多个无转移器官中建立转移前微环境（PMNs），并且重塑细胞功能[3]。肝脏作为肿瘤EVP靶向的主要器官之一[4]，无肿瘤转移的肝脏功能重塑领域还未得到广泛研究，以及EVP如何改变肝脏功能及其作用机制还有待阐明。
2023年5月，Nature期刊上报道了一项肿瘤细胞外囊泡和颗粒（EVP）引起肝脏代谢功能障碍的研究，揭示了肿瘤来源EVP是癌症诱导肝脏功能重塑的关键介质，证明了包裹在肿瘤EVP里的饱和脂肪酸会诱导肝脏Kupffer细胞分泌肿瘤坏死因子（TNF)，产生促炎性肝脏微环境，抑制脂肪酸代谢和氧化磷酸化，从而促进脂肪肝形成和肝脏代谢功能障碍，降低化疗耐受性。通过消除Kupffer细胞或阻断TNF可显著性抑制肿瘤诱导的脂肪肝形成，可能具有增强化疗疗效的作用[5]。
首先，研究者探索癌症是如何影响肝脏的。将容易发生肺部转移的B16F10黑色素瘤细胞和K7M2骨肉瘤细胞分别原位植入小鼠，3-4周后，两种模型均未观察到肿瘤肝转移，且仅有K7M2模型检测到肺转移。对无癌症转移的肝脏进行RNA测序分析，发现这两种肿瘤移植模型中有469个上调基因和317个下调基因的表达变化相一致（图一a)。基因集富集分析（GSEA）发现免疫稳态和代谢的失调，包括炎症反应和TNF激活NF-κB通路的上调，以及氧化磷酸化和脂肪酸代谢的下调（图一b)，表明尽管没有发生肿瘤肝转移，不同类型肿瘤仍系统地、一致地重塑了小鼠肝脏功能。脂质组学质谱分析显示，两种荷瘤小鼠肝脏的多种脂质类别，如磷脂、鞘脂、中性脂质、胆固醇酯和甘油三酸酯显著升高（图一c和d)；BODIPY染色发现肝脏脂滴积聚增加，表现出脂肪肝特性（图一e和f)。研究者进一步确定该结果的临床相关性，对发生肝外转移的胰腺导管腺癌（PDAC）患者的肝活检进行RNA-seq分析，发现了类似的免疫稳态和代谢功能紊乱（图一g)，以及在相近的体脂率下，表现出脂肪肝疾病（图一h)。以上数据表明，在没有肿瘤肝转移的情况下，远端肿瘤可以破坏肝脏代谢，并诱导癌症小鼠以及患者形成脂肪肝。
图一 远端原发性肿瘤诱发肝脏的代谢功能障碍[5]
肝脏是肿瘤EVP的主要靶标器官[4]。于是，研究者探索是否是肿瘤EVP靶向肝脏引起代谢功能障碍和脂肪肝的形成。从B16F10和K7M2肿瘤外植体中分离出EVP（TE-EVP)，经近红外染料标记，尾静脉注射至小鼠体内24小时，全器官成像证实肝脏摄取了TE-EVP（图二a和b）。为了更好地模拟肿瘤EVP的作用，研究者将TE-EVP两天一次尾静脉注射入小鼠体内，连续EVP培养4周后进行肝脏分析。在TE-EVP培养的肝脏中，转录组分析显示炎症反应增加和代谢降低（图二c和d)；代谢组学发现脂质代谢相关途径、氨基酸和碳水化合物的富集（图二e和f)；脂质组学发现神经酰胺、胆固醇酯、甘油三酯的丰度上调（图二g和h)；以及脂滴积聚增加（图二i和j)。将EVP进一步分成大外泌体、小外泌体和外泌颗粒三种亚群，同样注射培养4周，BODIPY染色发现它们均可诱导肝脏脂滴积聚的增加（图二k和l)。以上数据表明，肿瘤EVP是癌症诱导肝脏功能重塑的关键介质，可系统性地破坏肝脏代谢，诱导脂肪肝的形成。
图二 肿瘤来源的EVP诱导肝脏代谢功能障碍[5]
为明确肿瘤EVP靶向的肝脏细胞类型，研究者从B16F10和K7M2细胞中分离出EVP（CL-EVP）荧光标记后注射到小鼠，24h后肝脏流式分析发现，CL-EVP主要被CD45+免疫细胞和CD31+血管内皮细胞吸收，其中超过90%吸收EVP的CD45+免疫细胞是Cd11b+F4/80+的Kupffer细胞（图三a和b)。于是，研究者在两种肿瘤植入后第12或15天时，静脉注射氯膦酸盐脂质体去除荷瘤小鼠的Kupffer细胞（图三c)，发现两种肿瘤移植模型小鼠的肝脏脂滴积聚显著减少，且不影响原发肿瘤的生长（图三d)。研究者利用Kupffer细胞清除小鼠的精密肝切片（PCLS）进行体外EVP处理，两种肿瘤模型的CL-EVP和TE-EVP都不能诱导脂滴形成（图三e和f)。以上数据表明，Kupffer细胞对于肿瘤EVP诱导的脂肪肝形成是必要的。
图三 Kupffer细胞摄取肿瘤EVP可诱导脂肪肝的形成[5]
研究者在两种肿瘤移植模型小鼠分离的Kupffer细胞中发现多种细胞因子的富集，提示存在着炎症性肝脏微环境。酶联免疫吸附试验（ELISA）证实，荷瘤小鼠以及CL-EVP或TE-EVP培养小鼠的血浆TNF水平显著高于对照组（图四a和b)。用重组TNF处理原代肝细胞，发现显著诱导脂滴的形成（图四c)。于是，研究者给荷瘤小鼠腹腔注射TNF阻断抗体，观察到在不影响肿瘤生长的情况下，肝脏脂滴积累的减少（图四d)，TNF抗体处理CL-EVP培养小鼠也获得了类似的结果（图四e)。为了研究EVP包裹的哪些物质导致了Kupffer细胞的激活，研究者采用代谢物质谱分析发现长链饱和脂肪酸在B16F10-TE-EVP中富集。经游离脂肪酸的定量质谱证实，CL-EVP中存在着多种饱和脂肪酸（棕榈酸浓度最高）和不饱和脂肪酸的富集（图四f和g)。脂肪酸合成酶抑制剂C75的处理显著减少了游离脂肪酸含量，进而降低了EVP诱导Kupffer细胞的Tnf表达（图四h)。据报道，饱和脂肪酸可促进TLR4依赖的信号转导[6]。于是，研究者用TLR4抑制剂TAK预处理Kupffer细胞1小时，再用CL-EVP培养处理4小时，发现抑制TLR4可显著性降低CL-EVP诱导的Tnf表达（图四i)。以上数据表明，肿瘤EVP包裹的棕榈酸等脂肪酸可诱导Kupffer细胞分泌TNF，而特异性阻断TNF可显著降低肿瘤诱导的脂肪肝生成。
图四 肿瘤EVP包裹的棕榈酸可诱导Kupffer细胞分泌TNF并促进脂肪肝生成[5]
据报道，晚期癌症患者对标准化疗的耐受性较低，可能是由于肝脏的解毒功能受损[7]。研究者猜测肿瘤EVP诱导的脂肪肝和炎症可能会抑制肝脏的药物代谢，经实验发现重组TNF下调了小鼠肝细胞中与人细胞色素P450同源的多个Cyp核心基因的表达（图五a)，这些基因在荷瘤小鼠或CL-EVP培养小鼠的肝细胞中也被下调表达，并在特异性阻断TNF后重新挽救表达（图五b和c)。GSEA显示，在TNF处理的原代肝细胞、荷瘤小鼠以及肝外转移的胰腺癌患者的肝脏中，药物代谢细胞色素P450信号通路均被下调（图五d)。由于肿瘤EVP诱导的药物代谢受损可能引起化疗毒性，因此研究者评估了达卡巴嗪和阿霉素的毒性。采用B16F10-CL-EVP预培养小鼠一周后，腹腔注射达卡巴嗪或0.9%氯化钠，发现EVP培养小鼠的红细胞、网织红细胞和血红蛋白均显著性下降（图五e)。另外，采用K7M2-CL-EVP预培养小鼠25天后，腹腔注射阿霉素或DMSO，超声心动图显示，阿霉素降低了EVP培养小鼠的左心室射血分数和缩短分数（图五f)，出现心力衰竭症状。以上数据表明，肿瘤EVP通过损害肝脏药物代谢来增强化疗毒性，进而降低了癌症患者的化疗耐受性。
图五 肿瘤EVP可抑制肝脏药物代谢，增强化疗毒性[5]
综上所述，研究者证明了远端肿瘤分泌的EVP可在无转移肝脏中诱导炎症并下调脂质分解代谢，实现对小鼠和癌症患者的肝脏功能重塑（图五g)。通过在多种小鼠肿瘤模型和肿瘤患者的肝组织中进行多组学分析，证明了肿瘤EVP诱导的TNF分泌增加，可下调肝脏Cyp基因的表达，进而损害药物代谢功能。提示将TNF抑制剂与化疗相结合，可能恢复化疗癌症患者的肝功能，突出了癌症治疗中需考虑全身性、系统性影响的重要性。
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参考文献
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