技术分享：Ssh2通过调节微丝重塑参与精子顶体形成
非梗阻性无精子症的最常见原因是精子发生受损，约占男性不育的15% [1]。精子发生是指在睾丸曲细精管内产生精子的连续过程，包括未分化精原细胞的有丝分裂、精母细胞的减数分裂以及最终的精子细胞变态三个阶段[2]。减数分裂后精子细胞变态形成成熟精子的过程又被称为精子形成[3]，其特征是单倍体精子细胞经过时序性形态变化，包括细胞核压缩，鞭毛和顶体的形成，细胞质丢失等，最终形成精子。球形精子细胞的变形过程涉及到细胞骨架系统，尤其是微丝[4]，它通过各种辅助蛋白如肌动蛋白结合蛋白PROFILIN-3协调细胞骨架重塑，将蛋白质和囊泡运送到新生的顶体[5]。细胞骨架系统介导的前顶体囊泡形成、运输及融合，逐渐形成位于精子头部细胞核前方的膜状细胞器顶体。它是精子特有的一种溶酶体样细胞器，在卵子受精中发挥重要作用。尽管在顶体形成方面已经取得一些研究进展，但肌动蛋白组织参与这一过程的分子基础仍有待研究。丝切蛋白磷酸酶2（SSH2）作为一种肌动蛋白重塑调节因子[6]，被发现在小鼠精子发生的过程中增加表达[7]，提示其可能参与减数分裂。
2023年3月，eLife期刊上报道了丝切蛋白磷酸酶2（Ssh2）参与小鼠精子顶体形成的新机制。研究者通过采用Ssh2敲除小鼠（Ssh2 KO）和敲入血凝素（HA）蛋白标签的Ssh2-HA小鼠，揭示Ssh2通过调节丝切蛋白（Cofilin）的磷酸化，参与微丝结构重塑，进而影响精子顶体形成过程中的前顶体囊泡运输与融合，对于顶体形成和雄性生殖是必不可少的[8]。
首先，研究者构建了敲除第8号外显子的Ssh2 KO小鼠（图一A）来研究Ssh2在雄性生育中的作用。将Ssh2 KO小鼠整个睾丸裂解物进行蛋白质免疫印迹（WB）分析，验证了Ssh2的缺失表达（图一B），且发现雄性小鼠完全不育（图一C）。与同窝WT小鼠相比，Ssh2 KO雄鼠的睾丸大小、体重、睾丸重量、睾丸与体重比并没有差异（图一D-G）。但通过苏木精染色发现，Ssh2 KO雄鼠的精子发生受损，附睾腔中未观察到成熟精子（图一H），附睾尾部的精子计数也证实了这一点（图一I）。以上数据表明，Ssh2对雄性生育能力是至关重要的。
图一 Ssh2敲除导致雄鼠严重的生殖缺陷和雄性不育[8]
为了确定Ssh2 KO雄鼠精子发生的阻滞时间点，研究者使用苏木精和过碘酸希夫（PAS）对睾丸组织切片进行染色，发现Ssh2 KO小鼠的精子发生阻滞在Ⅱ-Ⅲ期（图二A），终止于早期step 1-3球形精子阶段。此外，在Ssh2 KO小鼠曲细精管中还观察到成簇聚集的球形精子细胞（cRS）和凋亡样生殖细胞（aRS）（图二A）。采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）测定睾丸和附睾中的凋亡信号，发现Ssh2 KO小鼠曲细精管和附睾管腔中凋亡精子细胞数量显著增加（图二B-D），并且在睾丸裂解物中检测到促凋亡信号分子BAX，BAD，Caspase-3和裂解Caspase-3蛋白水平显著升高，同时抗凋亡BCL-2的蛋白水平相对降低（图二E）。以上结果表明，Ssh2敲除导致精子发生停滞和生殖细胞凋亡。
图二 Ssh2敲除导致精子发生停滞和生殖细胞凋亡增强[8]
接下来，研究者评估Ssh2 KO小鼠分化精子细胞的形态。对顶体形成的不同阶段进行花生凝集素（PNA）免疫荧光染色，发现与WT精子细胞中看到的完整顶体囊泡不同，大多数Ssh2 KO精子细胞中存在多个分散的前顶体囊泡，它们并没有相互融合（1-3步）（图三A），表明Ssh2 KO小鼠的顶体形成是从高尔基期开始被破坏的。通过透射电镜（TEM）观察，发现Ssh2 KO精子细胞出现高尔基堆层增厚，尽管前顶体囊泡可被反式高尔基体释放，但是不能融合形成一个完整的顶体泡（图三B）。此外，在核膜附近没有观察到顶体下层板（acroplaxome）样结构（图三B）。这种顶体形成受损表型与Gm130突变小鼠相似[9]。于是，研究者进行Gm130和PNA免疫共染色，发现在WT精子细胞中观察到具有囊泡状和堆叠状形状的Gm130信号与PNA标记的顶体囊泡紧密接触。然而，在Ssh2 KO精子细胞中仅观察到大的Gm130阳性聚集体，且与PNA阳性前顶体囊泡并不接触（图三C）。以上数据表明，Ssh2 KO导致前顶体囊泡融合失败，提示Ssh2在精子细胞顶体形成过程中发挥了重要作用。
图三 Ssh2敲除导致顶体形成被破坏[8]
为了研究Ssh2在精子发生中的功能，研究者检测了不同睾丸发育时期的Ssh2蛋白表达谱式，发现其在小鼠精子发生过程中逐渐增加（图四A），并且主要表达在精母细胞和球形精子细胞中（图四B）。与WT小鼠相比，Ssh2 KO小鼠精子细胞无Ssh2信号，且出现碎片化顶体（图四B和C）。此外，研究者构建了Ssh2-HA标签小鼠来检测顶体形成过程中Ssh2的动态性表达情况，利用HA标签，同样观察到Ssh2-HA主要定位于精母细胞和球形精子细胞的细胞质中，并在顶体区密集积累（图四D和E）。以上数据表明，Ssh2的功能与顶体形成具有相关性。
图四 Ssh2表达积累在精子细胞的顶体区[8]
据报道SSH2可结合在F-肌动蛋白（F-actin）上拮抗LIMK1介导的肌动蛋白聚合[10]。于是，研究者用鬼笔环肽染色来标记F-actin，发现Ssh2 KO精子细胞的F-actin结构发生改变，出现许多异常聚集信号（图五A和B），提示Ssh2 KO加速了微丝生长。Ssh2是丝切蛋白（Cofilin）的特异性磷酸酶[10]，后者负责特异性解聚微丝蛋白。研究者进一步发现，Ssh2 KO小鼠睾丸的磷酸化Cofilin蛋白水平升高，而总Cofilin以及Cofilin蛋白激酶Limk1和Limk2的蛋白水平没有显著差异（图五C）；免疫荧光染色也证明了磷酸化Cofilin在细胞核和细胞质的表达均显著增加，特别是在精子细胞（图五D）；随着磷酸化Cofilin的增加，相应的F-actin的表达增加（图五E），并且普遍存在的磷酸化Cofilin信号与结构异常的F-actin聚集物具有共定位（图五F）。以上数据表明，在顶体形成过程中，Ssh2通过调控Cofilin磷酸化来协调F-actin重塑。
图五 Ssh2敲除导致Cofilin磷酸化调节受损以及微丝结构异常[8]
综上所述，本文揭示了Ssh2在顶体形成和雄性生育能力中的重要调控作用。利用Ssh2 KO小鼠发现了精子发生阻滞的生殖表型和增强的生殖细胞凋亡现象，最终导致雄性不育。Ssh2定位于减数分裂后的球形精子细胞，并在顶体区积累，这一点在Ssh2-HA小鼠中得到了证实。在精子形成过程中，Ssh2 KO精子细胞顶体异常，前顶体囊泡没有融合，并伴有F-actin结构紊乱，同时Cofilin过度磷酸化。本文揭示了Ssh2通过调节Cofilin的磷酸化，参与微丝结构重塑，进而影响精子顶体形成的新机制，为非梗阻性无精子症的致病机制提供了新的思路。
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