技术分享：肝源性FGF21通过激活去甲肾上腺素能神经系统来加速醒酒

成熟水果和花蜜中的单糖是许多动物的主要热量来源。然而，这些糖经自然发酵产生的乙醇被食用后会导致酒精中毒，损害个体的行动力和判断力[1]。因此，食用果糖和其他单糖的动物早已进化出肝脏酶来分解代谢乙醇。FGF21是一种由多种代谢应激（如饥饿、蛋白质缺乏、单糖和乙醇）诱导肝脏产生的激素[2, 3] ，它作用于由传统FGF受体酪氨酸激酶（FGFR1c）与单次跨膜蛋白β-Klotho（KLB) 组成的细胞表面受体复合物。先前的研究表明，FGF21能在小鼠和人类肝脏中抑制乙醇偏好[4]，诱导个体饮水以防止脱水[5]，以及防止酒精暴露引起肝损伤[6]。

2023年3月，Cell Metabolism 杂志上报道了FGF21加速醒酒的新功能及其作用机制。由乙醇强烈诱导产生的FGF21激素可在不改变乙醇分解代谢的情况下，直接激活蓝斑（locus coeruleus，LC）区域的去甲肾上腺素能神经元，加速恢复小鼠醉酒后引起的翻正反射和平衡的丧失，即具有缓解酒精中毒的生理作用。FGF21不能拮抗氯胺酮、地西泮和戊巴比妥等镇静剂，其缓解酒精中毒的功能具有特异性。外源性注射FGF21还能进一步加速缓解酒精中毒，具有抗醉酒作用，为治疗急性酒精中毒提供了潜在药物靶点[7]。

首先，研究者探索了FGF21在酒精中毒中的生理作用。对野生型(WT)和全身性敲除Fgf21^-/-小鼠单次灌胃给予大剂量乙醇（5 g/kg)，发现乙醇强烈诱导了WT小鼠血浆中FGF21的表达，并在酒精暴露2小时后达到峰值（图一A)。在动物翻正反射检测中，发现虽然WT和Fgf21^-/-小鼠在乙醇灌胃后约15-20分钟都失去了翻正反射，即失去意识（图一B)，但Fgf21^-/-小鼠需要比WT小鼠多花约1.5小时才能够恢复（图一C)。两组小鼠清除血浆中乙醇的速率相同（图一D)，并且脑部的乙醇浓度相似（图一E），表明FGF21可以在不影响乙醇分解代谢的情况下，防止乙醇引起的翻正反射丧失。另外，研究者还在肝细胞特异性Fgf21敲除（Fgf21^Alb）小鼠和神经特异性Klb敲除（Klb^Camk2a）小鼠中获得了相似的翻正反射丧失时间及其持续时间，敲除小鼠和对照小鼠之间血浆的乙醇清除率也均无差异。以上数据表明，肝源性FGF21通过作用于其神经系统受体，加速恢复了由乙醇引起的翻正反射丧失，即可帮助醒酒。

图一 Fgf21缺乏会延长小鼠的醉酒时间[7]

于是，研究者检测FGF21的给药能否进一步帮助野生型小鼠醒酒。给WT小鼠单次灌胃大剂量乙醇（5 g/kg），一小时后小鼠仍然醉酒时，腹腔注射重组FGF21。结果发现，FGF21给药均能促使雄性和雌性小鼠恢复翻正反射的时间减少约1.5小时，大约缩短一半的醒酒时间（图二A和B)。FGF21表现为剂量依赖性，最大效应浓度为1 mg/kg（图二A)。研究者在Fgf21^-/-和Klb^Camk2a小鼠中进行了相同的FGF21给药实验，发现Fgf21^-/-小鼠在FGF21给药后与WT小鼠的恢复时间相同（图二C)，但是Klb^Camk2a小鼠在FGF21给药后没能恢复（图二D)，表明药理学上FGF21通过其神经系统的受体发挥作用。

图二 FGF21给药可恢复乙醇中毒导致的翻正反射丧失和运动失调[7]

接着，研究者检测了腹腔注射中等剂量乙醇（2 g/kg）的小鼠运动协调性，发现FGF21给药缩短了WT小鼠在旋转器上恢复运动协调所需的时间（图二E)，但是Fgf21^-/-小鼠的恢复时间显著增加（图二F)。此外，研究者检测了FGF21对其他镇静剂的作用，给小鼠腹腔注射乙醇或其他镇静剂氯胺酮、地西泮和戊巴比妥，30分钟后再腹腔注射FGF21。结果发现，FGF21仅缩短了乙醇处理小鼠的翻正反射恢复时间（图二G)，对其他镇静剂的处理影响不大（图二H-J)。以上数据表明，药理学上FGF21加速恢复了酒精引起的翻正反射丧失和运动失调，并且该作用仅选择性针对酒精。

据报道，乙醇处理会激活蓝斑神经元[8]。蓝斑是去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）合成的主要部位，其功能与应激反应有关，参与唤醒与警戒。不能合成NE的Dbh敲除小鼠具有延长的乙醇引起翻正反射恢复时间，且不影响乙醇分解代谢[9]，类似于在Fgf21^-/-小鼠中观察到的现象。基于这些发现，研究者探索FGF21是否参与乙醇诱导的蓝斑去甲肾上腺素能神经元的激活。给WT和Fgf21^-/-小鼠灌胃乙醇（5 g/kg）2.5小时后，对蓝斑切片进行c-Fos和NE转运体（NET）的免疫染色，它们分别是神经元活性和去甲肾上腺素能神经元的标志物。结果发现，乙醇处理可诱导WT小鼠NET⁺蓝斑神经元的c-Fos表达，但在Fgf21^-/-小鼠中完全没有这种激活作用（图三A和B)。并且WT和Fgf21^-/-小鼠的NET⁺细胞总数相等（图三B)，表明FGF21的缺失不会损害这种神经元谱系。以上数据表明，乙醇激活蓝斑去甲肾上腺素能神经元的过程需要FGF21。

图三 FGF21是去甲肾上腺素能神经元的生理调节因子[7]

下一步，研究者探究FGF21是否直接作用于蓝斑去甲肾上腺素能神经元，检测FGF21的特异性受体KLB是否存在于蓝斑中。由于缺乏可靠的KLB抗体，使用已建立的KLB-tdTomato报告小鼠来检测KLB-tdTomato融合蛋白的表达[10]。通过免疫染色检测发现，蓝斑NET与KLB-tdTomato有许多但不是全部的细胞共定位，并且在蓝斑邻近的NET-细胞中也能检测到KLB-tdTomato的表达（图四A)，表明KLB在去甲肾上腺素能神经元、蓝斑及其周围的其他细胞类型中都有表达。FGF21给药可诱导WT小鼠NET⁺蓝斑神经元的c-Fos激活表达（图四B和C)，但是对Klb^Camk2a小鼠没有激活作用（图四D)，表明FGF21直接作用于蓝斑去甲肾上腺素能神经元。

图四 FGF21直接作用于蓝斑去甲肾上腺素能神经元[7]

最后，为了测试去甲肾上腺素能神经元是否是FGF21抗酒精中毒活性所必需的，研究者采用了互补的基因敲除策略和药理学抑制方法。为选择性消除神经元中NE的产生，研究者生成了一个floxed-Dbh小鼠系，并将其与Camk2a-Cre小鼠杂交，获得Dbh^Camk2a小鼠。结果发现，DBH的表达确实在Dbh^Camk2a小鼠的蓝斑中被去除，但仍在肾上腺髓质中表达（图五A)，Dbh^Camk2a小鼠对FGF21帮助翻正反射的效应完全不敏感（图五B)。神经毒素DSP-4可选择性且不可逆地抑制NE信号，用DSP-4预处理WT小鼠，可消除FGF21对翻正反射的效应（图五C)。NE从神经元释放出来后，作用于多个皮质下区域的α₁和β肾上腺素受体，以刺激唤醒[11]。同样地，FGF21的抗中毒作用也分别被α₁和β肾上腺素受体的选择性拮抗剂哌唑嗪和普萘洛尔阻断（图五D和E)。以上数据表明，FGF21通过激活神经系统的去甲肾上腺素能神经元来刺激唤醒。

图五 FGF21通过去甲肾上腺素能神经元来发挥其抗酒精中毒活性[7]

综上所述，本研究发现了FGF21在酒精暴露后的新功能，可以通过直接作用于蓝斑参与调节唤醒和警戒的去甲肾上腺素能神经元并使之激活，调节其抗醉酒的作用，进而加速从乙醇引起的意识丧失和运动失调中恢复。这种FGF21缓解酒精中毒的功能具有特异性，不能拮抗氯胺酮、地西泮和戊巴比妥等镇静剂。本研究揭示了FGF21作为肝源性的内源激素，通过酒精刺激的肝-脑通路来行使解酒功能的新机制，为治疗急性酒精中毒提供了潜在的药物靶点。

GTP研发中心拥有自主知识产权的“人造精子细胞”介导的半克隆技术，可在体外实现“人造精子细胞”的多位点改造并进行功能元件测试，最后将“人造精子细胞”通过卵母细胞注射可以一步法获得基因改造小鼠。基于“人造精子细胞”单倍体打靶高效率的优势，可快速构建定制化小鼠，如基因组安全位点大片段敲入、条件性基因敲除/敲入和人源化基因改造等。多个复杂调控元件可以通过多次体外细胞打靶构建在同一株“人造精子细胞”中，经细胞水平质控后，一步法获得基因改造小鼠。

如有需要欢迎联系我们，GTP研发中心将竭诚为您设计最佳方案，制定专属于您的基因改造小鼠。

网址：http://www.sibcb.ac.cn/gtp/

邮箱：gtp_order@sibcb.ac.cn

地址：上海市岳阳路320号

责任编辑：多一百

新媒体运营：suway

参考文献

1. Dudley R, Maro A: Human Evolution and Dietary Ethanol. Nutrients 2021, 13(7).

2. Fisher FM, Maratos-Flier E: Understanding the Physiology of FGF21. Annu Rev Physiol 2016, 78:223-241.

3. Owen BM, Mangelsdorf DJ, Kliewer SA: Tissue-specific actions of the metabolic hormones FGF15/19 and FGF21. Trends Endocrinol Metab 2015, 26(1):22-29.

4. Schumann G, Liu C, O'Reilly P, Gao H, Song P, Xu B, Ruggeri B, Amin N, Jia T, Preis S et al: KLB is associated with alcohol drinking, and its gene product beta-Klotho is necessary for FGF21 regulation of alcohol preference. Proc Natl Acad Sci U S A 2016, 113(50):14372-14377.

5. Song P, Zechner C, Hernandez G, Canovas J, Xie Y, Sondhi V, Wagner M, Stadlbauer V, Horvath A, Leber B et al: The Hormone FGF21 Stimulates Water Drinking in Response to Ketogenic Diet and Alcohol. Cell Metab 2018, 27(6):1338-1347 e1334.

6. Liu Y, Zhao C, Xiao J, Liu L, Zhang M, Wang C, Wu G, Zheng MH, Xu LM, Chen YP et al: Fibroblast growth factor 21 deficiency exacerbates chronic alcohol-induced hepatic steatosis and injury. Sci Rep 2016, 6:31026.

7. Choi M, Schneeberger M, Fan W, Bugde A, Gautron L, Vale K, Hammer RE, Zhang Y, Friedman JM, Mangelsdorf DJ et al: FGF21 counteracts alcohol intoxication by activating the noradrenergic nervous system. Cell Metab 2023, 35(3):429-437 e425.

8. Chang SL, Patel NA, Romero AA: Activation and desensitization of Fos immunoreactivity in the rat brain following ethanol administration. Brain Res 1995, 679(1):89-98.

9. Weinshenker D, Rust NC, Miller NS, Palmiter RD: Ethanol-associated behaviors of mice lacking norepinephrine. J Neurosci 2000, 20(9):3157-3164.

10. Coate KC, Hernandez G, Thorne CA, Sun S, Le TDV, Vale K, Kliewer SA, Mangelsdorf DJ: FGF21 Is an Exocrine Pancreas Secretagogue. Cell Metab 2017, 25(2):472-480.

11. Berridge CW, Schmeichel BE, Espana RA: Noradrenergic modulation of wakefulness/arousal. Sleep Med Rev 2012, 16(2):187-197.