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科研进展

 

李劲松研究组建立过滤富集单倍体胚胎干细胞的方法

        2月15日,国际学术期刊Journal of Biological Chemistry 在线发表了李劲松研究组题为Haploid embryonic stem cells can be enriched and maintained by simple filtration的文章。该文章建立了一种简单、可靠且有效的单倍体细胞富集方法。
 
        多年来科学家对单倍体细胞的探索始终孜孜不倦。2011年,小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞(parthenogenetic haploid embryonic stem cells, PG-haESCs)建立。2012年,小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞(androgenetic haploid embryonic stem cells, AG-haESCs)建立。随后,大鼠、猴子和人的haESCs也相继建立。单倍体细胞因其只含有一套染色体,不会遮盖隐性性状,在研究基因功能上可提供很大的帮助;它还具有干细胞的特性,能体外无限增殖且具有干性;同时小鼠的孤雄单倍体胚胎干细胞具有类精子的特性,主要表现在能使小鼠的卵母细胞受精并生出半克隆小鼠。将这些特性联合到一起,就小鼠的haESCs而言,不仅在细胞水平同时也在个体水平搭起了研究基因功能的桥梁。
 
       然而,美中不足,haESCs自出生就伴随着不断自发二倍化的问题。自发二倍化也使得从ESCs建立之初,科学家就尝试建立haESCs但没有成功,直到流式分选技术(fluorescence activated cell sorter, FACS)被应用到单倍体的富集上。其原理是, Hoechst染色后,不同DNA含量的细胞在激光照射下会被区分开,通过给单倍体细胞加电使其发生偏转后收集下来,从而实现单倍体细胞富集。但是,Hoechst染料会一定程度影响DNA复制。 FACS富集回来的细胞第一代生长状态远不如正常传代的细胞。而且暂不论流式分选所需的设备及费用,整个过程中的激光照射,加电加压等可能给细胞带来额外潜在的基因突变。另外,该方法需要复杂、昂贵的仪器支持,富集成本高。
 
        在此背景下,李劲松研究组根据单倍体细胞与二倍化了的细胞的平均直径的差异,通过过滤的方法在体外稳定地维持单倍体细胞单倍体性超过30代。该过滤系统由商业化的一片布满5μm或8μm小孔的滤膜与一个滤膜的支撑装置,外加一个注射器组成。成本很低且均可实现无菌操作。对细胞活性及单克隆形成能力的研究发现过滤第一代细胞远优于FACS富集的细胞。与此同时,过滤不同次数的AG-haESCs仍能正常支持半克隆小鼠的出生。并且,CRISPR/Cas9介导的基因敲除与敲入均可在过滤富集的细胞上正常实现,相应基因敲除的半克隆小鼠也正常出生。除此之外,该方法也可用于小鼠单倍体细胞的建立以及人的单倍体细胞的富集。过滤富集单倍体细胞的方法为单倍体细胞相关技术的发展、应用和推广提供了保障。
 
        瞿超和晏萌为本文的共同第一作者,该研究得到清华大学陈晔光教授的帮助;工作得到了全基因组标签计划(Genome Tagging Project, GTP),以及国家科技部、国家基金委、中国科学院(细胞命运可塑性先导B)和上海市科委经费的支持;同时获生化与细胞所公共技术服务中心动物实验技术平台、细胞生物学技术平台的大力支持。
 
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